肝癌中BVES低表達促進上皮間質(zhì)轉化及其與促腫瘤因子Netrin-1作用關系的研究.pdf

1、目的:肝癌死亡原因主要為侵襲轉移。肝癌侵襲轉移可分為多個階段,包括細胞間黏附下降、細胞外基質(zhì)降解、腫瘤細胞遷移、外侵以及遠處定植等環(huán)節(jié)。BVES是一個具有三次跨膜結構的黏附蛋白,研究發(fā)現(xiàn)其在維持上皮細胞完整性及調(diào)節(jié)細胞運動過程中具有重要作用,而這兩方面也正是目前腫瘤轉移研究的熱點。最近有研究報道BVES對一些上皮來源腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要作用,但具體的作用機制及上游調(diào)控因子還未闡明,BVES對肝癌的作用,尤其是肝癌細胞EMT的作用尚無報

2、道。本實驗首先研究BVES對肝癌細胞上皮間質(zhì)轉化(EMT)的作用,結合我們研究小組之前關于促腫瘤因子Netrin-1的研究,進一步探討Netrin-1與BVES的作用關系及可能的分子機制。
　　方法:應用qRT-PCR、Westernblot及免疫組化方法檢測21對肝癌手術標本癌及癌旁組織中BVES的表達。RT-PCR方法檢測不同轉移潛能肝癌細胞株中BVES的表達。構建針對BVESmRNA的siRNA(BVESsiRNA)及陰性對

3、照siRNA(ControlsiRNA)。在Huh7肝癌細胞中轉染BVES干擾片段后,qRT-PCR和Westernblot方法測定干擾效率及上皮細胞標志蛋白E鈣粘素(E-cadherin)和間質(zhì)細胞標志蛋白波形蛋白(Vimentin)的表達變化;qRT-PCR進一步檢測Twist1、Snail1、MMP2/MMP9和IL-6的表達;觀察肝癌細胞形態(tài)及細胞骨架改變;用Transwell檢測抑制BVES后肝癌細胞遷移、侵襲能力變化。觀測過

4、表達Netrin-1對肝癌細胞BVES表達的影響。給予Netrin-1蛋白作用肝癌細胞觀測其對肝癌細胞BVES表達的影響。Westernblot檢測Netrin-1蛋白對PI3K/Akt通路信號分子表達的作用,PI3K抑制劑LY294002預先處理肝癌細胞后探討PI3K/Akt通路在Netrin-1對BVES表達調(diào)節(jié)中的作用。
　　結果:在21對病理學診斷為肝癌及癌旁手術標本中,14例癌旁組織BVESmRNA的表達明顯高于癌組織,

5、陽性率達66.7％,免疫組化證實BVES主要表達于細胞質(zhì)及細胞膜。在不同轉移潛能肝細胞及肝癌細胞中,隨著轉移潛能增加,BVES表達減少。在Huh-7肝癌細胞中干擾BVES后發(fā)現(xiàn),肝癌細胞上皮標志蛋白E-cadherin減少68.20±0.72%(p<0.05),間質(zhì)標志蛋白Vimentin增加3.71±0.93倍(p<0.05);形態(tài)學上觀察到,干擾BVES后,Huh7肝癌細胞由橢圓形的上皮結構變?yōu)榘w狹長的間質(zhì)細胞結構,細胞連接減少,

6、鬼筆環(huán)肽檢測到細胞骨架發(fā)生重排。細胞遷移實驗結果顯示,干擾BVES后遷移細胞數(shù)(382±12)個,較對照組(180±10)個明顯增加(P<0.01);侵襲實驗結果顯示,干擾BVES后穿過基質(zhì)膠的細胞數(shù)(300±15)個,較對照組(120±12)個明顯增加(P<0.01),而24h細胞增殖無明顯改變。同時發(fā)現(xiàn),干擾BVES后,肝癌細胞中Twist1、Snail1、MMP2/MMP9及IL-6mRNA表達均增加。過表達Netrin-1及加入

7、重組人Netrin-1蛋白后,Huh7肝癌細胞BVES在mRNA和蛋白水平表達均減少,且Akt磷酸化增加。抑制Netrin-1下游PI3K/Akt信號通路后,BVES表達可恢復。
　　結論:BVES可能與肝癌侵襲轉移有關;其低表達具有促進肝癌細胞EMT的作用;肝癌細胞中BVES受Netrin-1調(diào)控,而PI3K/Akt信號通路可能在這個過程中具有重要作用。深入研究BVES在Netrin-1促進的肝癌細胞轉移中的分子機制,可能為抑制