中期因子誘導上皮間質轉化促進肝癌細胞肝內轉移和血液播散的初步研究.pdf

1、研究背景和目的
　　 肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)作為肝癌標志物，可反映腫瘤負荷，有助于部分肝癌診斷和療效監(jiān)測，但對于預后預測幾無作用。盡管已報道的其他標志物越來越多，但其臨床應用價值或者有限，或者需要廣泛驗證。因此，進一步鑒定能判斷肝癌轉移及預后的分子標志物，發(fā)展能準確預測肝癌復發(fā)轉移和預后的檢測手段

2、仍是肝癌研究領域的一個重要課題。中期因子(midkine，MK)是一種肝素結合因子，在包括肝癌在內的多種類型惡性腫瘤中高表達。它直接參與腫瘤的生長、轉移過程，在多種惡性腫瘤中高表達，有望成為一個新的腫瘤標志物。上皮-間質轉化(epithilial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細胞失去極性轉變成具有活動性的間質細胞的過程?，F(xiàn)有的研究表明，EM工程序激活使腫瘤細胞獲得異?；顒幽芰Γ瑥亩T導腫瘤進展、侵襲、擴散

3、，最終形成轉移。本研究首先建立檢測MK的肝素-ELISA方法，通過多種方法學分析以及臨床肝癌標本檢測，評價該方法的可行性，并將相同方法學原理用于MK和PTN(pleiotrophin，多向因子，與MK組成一個肝素結合生長因子家族)雙因子總量的初步檢測，為后續(xù)建立肝素結合分子群總量檢測方法積累實驗經驗和工作基礎。然后通過體外細胞研究和臨床標本檢測，建立MK誘導肝癌細胞EMT的實驗證據，初步探討MK通過誘導肝癌細胞EMT促進肝癌進展和轉移的

4、生物學作用。
　　 研究方法
　　 1.應用肝素-抗體雙夾心原理建立檢測MK的ELISA法，進行方法學研究。
　　 (1)基于MK對肝素的高親和力，應用肝素-抗體雙夾心原理建立檢測MK的ELISA法。
　　 (2)繪制標準曲線。
　　 (3)分析靈敏度試驗。
　　 (4)回收試驗。
　　 (5)線性評價。
　　 (6)精密度試驗。
　　 (7)方法學比較。
　

5、　 2.應用肝素-雙抗體夾心法檢測MK和PTN雙細胞因子總量的初步研究。
　　 3.肝癌血清MK含量檢測。
　　 4.MK誘導EMT促進肝癌細胞增殖、侵襲的體外實驗研究。
　　 (1)細胞增殖試驗。
　　 (2)細胞侵襲試驗。
　　 (3)細胞免疫熒光試驗。
　　 (4)Western blot分析。
　　 5.臨床肝癌標本MK、EMT分子標志物和循環(huán)腫瘤細胞(circulati

6、ng tumor cells，CTCs)檢測，以及這些指標之間的相關性分析。
　　 (1)免疫組織化學檢測肝癌組織中MK表達。
　　 (2)免疫組織化學檢測肝癌組織中E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)表達。
　　 (3)肝癌血液CTCs檢測。
　　 (4)肝癌組織MK表達與肝癌血清MK含量、肝癌組織E-cadherin表達、肝癌血液CTCs含量以及肝癌臨床病理學特征之間的相

7、關性分析。
　　 實驗結果
　　 1.建立了檢測MK含量的肝素-抗體ELISA法，基本符合實驗要求。
　　 (1)生物素化肝素與MK單克隆抗體的最佳工作濃度分別為2μg/mL和0.75μg/mL。
　　 (2)以各濃度的OD450為縱坐標，相應的濃度為橫坐標，得出標準曲線方程為y=1.2308x-0.0094，r=0.9973。
　　 (3)分析靈敏度為0.047ng/mL。
　　 (4)

8、MK回收率范圍為90.6～102.0％，平均為96.85±4.04％。
　　 (5)MK濃度在0.096～1.436ng/mL范圍內線性良好，得到的線性方程為y=1.1387x+0.011，r=0.998。
　　 (6)批內和批間變異系數(shù)(CV)分別為6.3～6.9％和9.0～9.8％。
　　 (7)與商品化人MKELISA試劑盒(雙抗體央心法)的檢測結果比較，二者之間的差異無顯著性(P=0.058)。線性回歸分

9、析結果表明，二者之間的相關性良好(r=0.9779)。
　　 2.MK和PTN雙細胞因子總量檢測的初步結果顯示，應用肝素-雙抗體夾心法可檢測2個肝素結合性細胞因子總量。
　　 3.臨床血清檢測結果顯示，20例正常人血清MK含量為(0.259±0.061)ng/mL，85例肝癌血清MK含量為(0.501±0.111)ng/mL，二者之間有顯著差異(P<0.05)。如果將0.382ng/mL設定為陽性界限，肝癌患者陽性率為8

10、5.9％。
　　 4.MK誘導肝癌細胞EMT的體外試驗結果顯示：
　　 (1)10nMMK刺激培養(yǎng)的肝癌細胞可獲得最高的增殖力和最強的侵襲力；
　　 (2)MK刺激的肝癌細胞發(fā)生了典型的EMT細胞形態(tài)學改變，細胞中vimentin表達上調，E-cadherin表達下調。
　　 5.臨床肝癌標本檢測結果表明：
　　 (1)肝癌組織表達MK高于配對癌旁組織；
　　 (2)肝癌血清MK表達與配對

11、肝癌組織MK含量正相關；
　　 (3)肝癌組織MK表達與TNM分期、肝內轉移有關(P<0.05)；
　　 (4)肝癌組織中存在vimentin表達上調，E-cadherin表達下調的現(xiàn)象。肝癌組織MK表達與E-cadherin表達負相關(P<0.05)；
　　 (5)80％肝癌患者外周血可檢出CTCs，檢出數(shù)為12.6±13.2。肝癌組織MK表達與肝癌CTCs正相關。
　　 結論
　　 建立了檢測