腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的交互作用促進(jìn)肺腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究.pdf

1、一、背景:
　　非小細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）是高發(fā)病率和死亡率的惡性腫瘤，約占肺癌所有病理類型的80~85%，以腺癌居多。盡管近年來 NSCLC的診斷和治療方面取得了一定的進(jìn)展，但5年生存率僅13%左右。因此，深入研究NSCLC惡性演進(jìn)的分子機(jī)制對于改善其療效和預(yù)后至關(guān)重要。近年來大量研究表明腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）是決定腫瘤惡性生物學(xué)行

2、為的關(guān)鍵因素。
　　腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAMs）是指在腫瘤組織中浸潤的巨噬細(xì)胞，是TME中數(shù)量最多的間質(zhì)細(xì)胞群。多項研究表明TAMs參與了腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等多個過程，且其浸潤數(shù)量與包括NSCLC在內(nèi)的多種實體瘤的治療耐藥和不良預(yù)后密切相關(guān)。TAMs的促腫瘤作用與其呈巨噬細(xì)胞M2極化表型有關(guān)。然而，TAMs在肺腺癌中的確切作用仍不清楚。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epit

3、helial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細(xì)胞失去極性并獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的過程，是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和遷移能力的重要步驟。大量研究表明，EMT與包括 NSCLC在內(nèi)的多種實體瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。在口腔鱗癌、胰腺癌等腫瘤中的初步研究顯示 TAMs能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，但其在肺腺癌中的作用仍不清楚。
　　異常的糖基化是腫瘤的標(biāo)志性特征之一。Lewis Y（LeY）是一種雙巖藻糖基化的

4、寡糖，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶4（Fucosyltransferase IV，F(xiàn)UT4）是LeY合成的關(guān)鍵酶。FUT4/LeY在包括肺癌在內(nèi)的多種實體瘤中高表達(dá)，并與侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)。然而，TAMs與FUT4/LeY介導(dǎo)的巖藻糖基化的關(guān)系目前未見報道。
　　泛素特異性肽酶22（ubiquitin-specific protease22，USP22）是一種新發(fā)現(xiàn)的去泛素化酶（deubiquitinase，DUB）家族成員，具有使組蛋白

5、H2A、H2B去泛素化、組蛋白H4乙酰化的功能。USP22在多種實體瘤中高表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、治療耐藥和不良預(yù)后密切相關(guān)。然而，TAMs與 USP22介導(dǎo)的去泛素化的關(guān)系目前未見報道。
　　本研究旨在探討肺腺癌中FUT4/LeY介導(dǎo)的巖藻糖基化在TAMs誘導(dǎo)的EMT中的作用，以及USP22介導(dǎo)的去泛素化在TAMs的趨化過程中的作用，有望為以TAMs為靶點(diǎn)的免疫治療提供新的理論依據(jù)。
　　二、方法:
　　1、收集2

6、015年1月~2015年6月于大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科切除并于病理科存檔的肺腺癌石蠟組織標(biāo)本60例。利用免疫組化方法檢測CD68、E-cadherin、LeY、USP22的表達(dá)。分析CD68、E-cadherin和LeY表達(dá)的相關(guān)性，以及CD68和USP22表達(dá)的相關(guān)性。利用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，以P＜0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。表達(dá)率的組間差異比較采用χ2檢驗。
　　2、利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組的FUT4干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至

7、人肺腺癌細(xì)胞系 A549和H1299細(xì)胞系中，通過G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 FUT4干擾質(zhì)粒的細(xì)胞克隆。構(gòu)建Ezrin的野生型（wild-type，WT）過表達(dá)載體及T567D點(diǎn)突變過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染。同樣的方法在人肺腺癌細(xì)胞系 H1299和 H358細(xì)胞系中分別構(gòu)建穩(wěn)定干擾或過表達(dá)USP22的細(xì)胞系。
　　3、ELISA方法檢測巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β1的表達(dá)，以及肺腺癌細(xì)胞系培養(yǎng)上清中IL-1、IL-6、IL-8、CCL-2、C

8、XCL1的表達(dá)。
　　4、Western blot方法檢測FUT4、LeY、EMT標(biāo)志蛋白、Ezrin、USP22、p65、H2B-ub1和IκB等蛋白的表達(dá)。
　　5、間接免疫熒光方法檢測β-catenin、F-actin及E-Cadherin的表達(dá)。
　　6、免疫共沉淀方法檢測Ezrin蛋白上LeY糖蛋白的表達(dá)，以及UEA凝集素識別的巖藻糖基化水平。
　　7、染色質(zhì)免疫共沉淀方法檢測H2B-Ubi與p65靶基

9、因的結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ（絲氨酸-5磷酸化位點(diǎn)）與p65靶基因的結(jié)合以及p65與靶基因的結(jié)合。
　　8、裸鼠成瘤實驗證明肺腺癌中FUT4/LeY對TAMs誘導(dǎo)的EMT的影響，以及USP22對TAMs浸潤的影響。
　　三、結(jié)果:
　?。ㄒ唬┠[瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞通過FUT4/LeY介導(dǎo)的Ezrin磷酸化促進(jìn)肺腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究
　　1、人類肺腺癌組織中E-cadherin和LeY的表達(dá)水平與TAMs的數(shù)量顯著相關(guān)

10、
　　TAMs陰性組中E-cadherin的表達(dá)顯著高于TAMs陽性組（P＜0.01），LeY的表達(dá)則顯著低于TAMs陽性組（P＜0.01）。TAMs的數(shù)量與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.505，P＜0.01），與LeY的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.55，P<0.01）。E-cadherin與LeY的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.798，P＜0.01）。
　　2、M2型巨噬細(xì)胞通過TGF-β1/smad信號通路促進(jìn)F

11、UT4/LeY的表達(dá)
　　M2巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基（TAMconditioned medium，TCM）中TGF-β1的表達(dá)水平與正常培養(yǎng)基相比顯著上調(diào)，且呈濃度依賴性。TCM能夠顯著上調(diào)FUT4/LeY的表達(dá)及Smad2/3的磷酸化，且呈濃度依賴性。LY36494和SB431542阻斷TGF-β1/Smad信號通路后，TCM則無法上調(diào)FUT4/LeY的表達(dá)。TGF-β1能夠顯著上調(diào)FUT4/LeY的表達(dá)，且呈濃度依賴性。
　

12、　3、FUT4/LeY在M2型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞骨架重構(gòu)及EMT中必不可少
　　A549和H1299細(xì)胞系中干擾FUT4后LeY的表達(dá)也顯著下調(diào)。TCM處理后，A549和H1299細(xì)胞由鵝卵石樣的上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形的間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，且間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin和Fibronectin的表達(dá)顯著上調(diào)。在上述兩個細(xì)胞系中穩(wěn)定干擾FUT4后，TCM則無法使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，同時間充質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)也顯著低于僅

13、用TCM處理組。聯(lián)用外源性LeY抗體和FUT4-shRNA處理 A549和 H1299細(xì)胞后，間充質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)較單用外源性 LeY抗體或FUT4shRNA處理下調(diào)更為明顯。TCM誘導(dǎo)后，對照組A549細(xì)胞胞膜上E-cadherin顯著下調(diào)，β-catenin由胞膜和胞漿移位至胞核，β-catenin的胞核表達(dá)顯著上調(diào)。在A549細(xì)胞中穩(wěn)定干擾FUT4后，E-cadherin的表達(dá)較單用TCM處理組顯著上調(diào)，β-catenin則由核內(nèi)重

14、新定位至胞膜和胞漿，且其核內(nèi)表達(dá)量較單用TCM處理組顯著下調(diào)。TCM處理后，A549細(xì)胞中的F-actin大量聚合，并延伸出偽足，而對照組的細(xì)胞骨架為網(wǎng)狀。在 A549細(xì)胞中穩(wěn)定干擾的表達(dá)后，TCM處理則不能使F-actin發(fā)生上述形態(tài)改變。
　　4、FUT4/LeY介導(dǎo)的Ezrin巖藻糖基化與Ezrin磷酸化密切相關(guān)
　　TCM能夠濃度依賴性地上調(diào)Ezrin蛋白T567位點(diǎn)磷酸化以及細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Vime

15、ntin和Snail的表達(dá)。在A549和H1299細(xì)胞中穩(wěn)定干擾FUT4后，TCM則無法上調(diào)上述蛋白的表達(dá)。在TCM處理的同時給予衣霉素預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ezrin的N-糖基化受抑制后，TCM無法有效誘導(dǎo)Ezrin發(fā)生磷酸化，同時N-cadherin、Vimentin和Snail的表達(dá)也并未明顯上調(diào)。
　　生物信息學(xué)預(yù)測（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）提示Ezrin蛋白擁有585個

16、氨基酸，其23-26（NTTG）及247-250（NISF）的氨基酸序列是兩個潛在的N-糖基化位點(diǎn)。免疫共沉淀方法證實Ezrin蛋白上存在LeY糖蛋白的表達(dá)。應(yīng)用UEA凝集素對Ezrin的巖藻糖基化水平進(jìn)行檢測，免疫共沉淀結(jié)果顯示穩(wěn)定干擾FUT4后Ezrin的巖藻糖基化水平顯著下降。
　　TCM處理條件下，過表達(dá)WT-Ezrin的載體能夠回補(bǔ)干擾FUT4所導(dǎo)致的Ezrin T567D位點(diǎn)磷酸化水平下調(diào)和間充質(zhì)標(biāo)志物下調(diào)。過表達(dá)T5

17、67D-Ezrin則未出現(xiàn)上述改變。
　　5、動物實驗證實M2型巨噬細(xì)胞通過上調(diào)LeY和p-Ezrin促進(jìn)肺腺癌發(fā)生EMT
　　將M2或M0型巨噬細(xì)胞與A549細(xì)胞1:4預(yù)混后進(jìn)行裸鼠皮下種瘤。M2組于第6天成瘤，M0組直至11天成瘤。M2組的腫瘤體積顯著高于M0組（P＜0.01）。M2組E-cadherin的表達(dá)顯著低于M0組，同時伴有Vimentin的表達(dá)上調(diào)。此外，M2組中LeY及p-Ezrin的表達(dá)顯著高于M0組。<

18、br>　?。ǘ︰SP22調(diào)控NF-κB通路促進(jìn)肺腺癌中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤的機(jī)制研究
　　1、人類肺腺癌組織中USP22的表達(dá)與TAMs的浸潤密切相關(guān)
　　USP22陽性組中TAMs的陽性率為84.2%（32/38），而USP22陰性組TAMs的陽性率為18.2%（4/22），具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。USP22的表達(dá)水平與TAMs的浸潤數(shù)量呈正相關(guān)（r=0.649，P＜0.01）。
　　2、USP22能

19、夠促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞中NF-κB靶基因的轉(zhuǎn)錄
　　選取USP22表達(dá)水平最高的H1299細(xì)胞系構(gòu)建穩(wěn)定干擾USP22的細(xì)胞系，選取USP22表達(dá)水平最低的H358細(xì)胞系構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)USP22的細(xì)胞系。在10ng/ml TNF-α處理30min條件下，干擾USP22能夠顯著抑制H1299細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-1、IL-6、IL-8、CCL-2、CXCL-1的表達(dá)，過表達(dá)USP22則顯著上調(diào)H358細(xì)胞培養(yǎng)基中上述因子的表達(dá)；未經(jīng)TNF-α

20、處理組則未出現(xiàn)上述改變。在10ng/ml TNF-α處理30min條件下，干擾p65的表達(dá)能夠顯著抑制USP22過表達(dá)導(dǎo)致的上述因子表達(dá)上調(diào)。
　　3、肺腺癌細(xì)胞中的USP22通過NF-κB通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤
　　在TNF-α處理條件下，干擾H1299細(xì)胞系中USP22的表達(dá)能夠顯著抑制巨噬細(xì)胞的侵襲，過表達(dá)H358細(xì)胞系中USP22的表達(dá)能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞的侵襲；而未經(jīng)TNF-α處理組則未出現(xiàn)上述改變。利用p65-si

21、RNA在穩(wěn)定過表達(dá)USP22的H358細(xì)胞系中干擾p65的表達(dá)能夠顯著抑制USP22過表達(dá)對巨噬細(xì)胞浸潤的促進(jìn)作用。
　　4、USP22通過去泛素化組蛋白H2B介導(dǎo)p65與其靶基因啟動子的結(jié)合
　　無論是否給予TNF-α處理，USP22干擾或過表達(dá)均無法影響IκB及p65的核定位。TNF-α處理條件下，干擾USP22的表達(dá)能夠抑制H2B-Ubi與p65靶基因的結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ與p65靶基因的結(jié)合，以及p65與靶基因的結(jié)合

22、。
　　5、動物實驗證實肺腺癌中的USP22能夠促進(jìn)TAMs的浸潤
　　將構(gòu)建的穩(wěn)定干擾USP22的USP22-sh1和sh-con H1299細(xì)胞接種至裸鼠皮下成瘤。USP22-sh1組的腫瘤體積（780±86mm3）顯著低于USP22 sh-con組（2200±231 mm3）（P＜0.01）。免疫組化顯示USP-sh1組H2B-Ubi的表達(dá)顯著高于USP22-sh-con組，USP-sh1組鼠巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80的

23、表達(dá)顯著低于USP22 sh-con組。組織勻漿中USP-sh1組IL-1、IL-6、CCL-2、CXCL1的表達(dá)水平均顯著低于USP22-sh-con組，而IL-8的表達(dá)并無差異。
　　四、結(jié)論:
　?。ㄒ唬┠[瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞通過FUT4/LeY介導(dǎo)的Ezrin磷酸化促進(jìn)肺腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究
　　1、人類肺腺癌組織中E-cadherin和LeY的表達(dá)水平與TAMs的數(shù)量顯著相關(guān)。
　　2、M2型巨噬細(xì)胞通

24、過TGF-β1/smad信號通路促進(jìn)FUT4/LeY的表達(dá)。
　　3、FUT4/LeY在M2型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞骨架重構(gòu)及EMT中必不可少。
　　4、FUT4/LeY介導(dǎo)的Ezrin巖藻糖基化與Ezrin磷酸化密切相關(guān)。
　　5、動物實驗證實M2型巨噬細(xì)胞通過上調(diào)LeY和p-Ezrin促進(jìn)肺腺癌發(fā)生EMT。
　?。ǘ︰SP22調(diào)控NF-κB通路促進(jìn)肺腺癌中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤的機(jī)制研究
　　1、人類肺腺癌