PTEN在肝癌惡性進(jìn)展過程中促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  原發(fā)性肝癌主要存在兩種組織類型:肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)和肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC),其中肝細(xì)胞肝癌最常見,約占70%到85%。肝炎病毒、酒精性肝病、黃曲霉毒素、吸煙、肥胖等被證明是肝癌發(fā)病的重要危險因素。肝臟腫瘤的臨床發(fā)生一般經(jīng)歷慢性肝炎,長期的慢性刺激或大范圍急性病變發(fā)展成肝硬化,最終肝癌產(chǎn)生。當(dāng)前肝移植及手

2、術(shù)切除等治療方案均未明顯改善患者預(yù)后,而且肝癌肝內(nèi)和門脈轉(zhuǎn)移對患者預(yù)后有重要影響。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多種因素多階段共同作用的結(jié)果,探索肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,對于控制和治療肝癌有十分重要的意義。
  PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome10)是第十號染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白類似物。在一些高度惡性腫瘤中常有PTEN缺失,如Cowden綜合征(Cowden's

3、 syndrome),又稱多發(fā)性錯構(gòu)瘤綜合征,它是PTEN胚系突變引起的常染色體遺傳疾病。PTEN具有蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶活性,主要通過拮抗PI3K/AKT信號通路,調(diào)控多種生命過程,如細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老、細(xì)胞黏附、極性、細(xì)胞骨架、染色體的完整性等。同時也有大量文獻(xiàn)報道PTEN在腫瘤惡性轉(zhuǎn)化過程中起到了非常重要的作用。
  上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指由于各種因素

4、的誘導(dǎo),上皮細(xì)胞自身骨架結(jié)構(gòu)改變,同時細(xì)胞間、細(xì)胞與基底膜間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間聯(lián)系也發(fā)生變化,獲得間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和特性的過程。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤惡性進(jìn)展的過程中有十分重要的意義,有文獻(xiàn)報道鼻咽癌細(xì)胞中,來源于EB病毒的miRNA EBV-miR-BART7-3p靶向抑癌基因PTEN,活化的PI3K/AKT/GSK-3β信號通路使核內(nèi)Snail和β-catenin集聚促進(jìn)EMT。
  本課題組先前在探索PTEN肝癌中作用的過程中,

5、發(fā)現(xiàn)肝癌中PTEN的表達(dá)并不因?yàn)槠渥鳛橐职┗蚨鴾p少,由此我們意圖通過探討PTEN在肝癌發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮作用的方式,以及其與EMT的關(guān)系,從而進(jìn)一步為肝癌患者判斷預(yù)后、評價轉(zhuǎn)移風(fēng)險及尋找肝癌治療新靶點(diǎn)提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
  方法:
  1、通過蛋白免疫印跡法和實(shí)時定量PCR檢測肝癌患者癌、癌旁、正常組織樣品中PTEN的表達(dá)情況;并用免疫組織化學(xué)的方法,分析肝癌組織芯片中PTEN的表達(dá)。
  2、通過測序分析

6、肝癌患者癌、正常組織以及肝癌細(xì)胞系中PTEN的突變情況;檢索腫瘤基因組數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫信息,對PTEN在肝癌中的突變情況進(jìn)行橫向和縱向比較。
  3、通過蛋白免疫印跡法檢測肝癌細(xì)胞系中PTEN的表達(dá)水平以及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)水平;通過CCK8增殖、遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)比較不同亞群肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力;在低糖培養(yǎng)基下,觀察不同亞群細(xì)胞的耐受能力。
  4、建立干擾P

7、TEN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,并用蛋白免疫印跡、RT-PCR檢測干擾效果及其對于細(xì)胞EMT狀態(tài)的影響;評估細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的變化。
  5、通過蛋白免疫印跡法觀察肝癌細(xì)胞系中過表達(dá)PTEN后,細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白標(biāo)志的變化;比較過表達(dá)PTEN對于細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力影響。
  6、使用TGF-β誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系發(fā)生EMT,利用蛋白免疫印跡法及實(shí)時定量PCR觀察誘導(dǎo)效果。
  7、使用TGF-β誘導(dǎo)干擾PTEN肝癌細(xì)胞系發(fā)生

8、EMT,利用蛋白免疫印跡法及實(shí)時定量PCR觀察誘導(dǎo)效果。
  8、使用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng),研究PTEN對于E-cadherin轉(zhuǎn)錄活性的影響。
  9、肝特異性敲除PTEN小鼠,使用DEN聯(lián)合CCl4的方案進(jìn)行誘癌,體內(nèi)試驗(yàn)研究PTEN對于在腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。
  10、肝特異性敲除PTEN小鼠與K-ras激活突變小鼠雜交,觀察小鼠生長。
  結(jié)果:
  1、盡管PTEN作為抑癌基因,但是其在肝癌組織

9、中的表達(dá)水平相較于癌旁和正常組織并不低。轉(zhuǎn)錄水平也證明癌中PTEN的表達(dá)要高于相應(yīng)的癌旁和正常組織。組織芯片結(jié)果顯示肝癌組織中PTEN表達(dá)并不低。
  2、27對臨床肝癌組織樣本以及肝癌細(xì)胞中未檢測到PTEN的突變。檢索TCGA數(shù)據(jù)庫, Liver Hepatocellular Carcinoma(AMC, Hepatology2014)和LiverHepatocellular Carcinoma(TCGA,Provisional

10、)中,PTEN突變分別為2%和7%。與其他種類的腫瘤縱向比較,突變水平很低。
  3、根據(jù)肝癌細(xì)胞系中EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)差異,分成以LO2、QSG-7701、SMMC-7721、HCC-LM3、PLC/REF/5、SK-Hep-1為代表的M群,它們高表達(dá)Vimentin;而E群細(xì)胞有HepG2、Huh7、MHCC97H、MHCC97L、PVTT,它們高表達(dá)E-cadherin。M群細(xì)胞中PTEN的表達(dá)水平要明顯高于E群細(xì)胞。

11、M群的細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力總體上要比E群的細(xì)胞強(qiáng),其生長更加依賴于葡萄糖。
  4、干擾PTEN,細(xì)胞內(nèi)間質(zhì)性相關(guān)指標(biāo)如N-cadherin、Vimentin在蛋白和RNA水平均下調(diào)。同時,細(xì)胞的遷移和侵襲能力在干擾PTEN后要明顯下降。
  5、上皮型Huh7細(xì)胞隨著PTEN腺病毒量的增加,轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)量升高,引起E-cadherin的下調(diào),間質(zhì)性標(biāo)志Vimentin表達(dá)上升。在間質(zhì)型細(xì)胞SMMC-7721

12、,過表達(dá)PTEN,引起轉(zhuǎn)錄因子Snail上調(diào)的同時也促進(jìn)了間質(zhì)性指標(biāo)N-cadherin、Vimentin的表達(dá)。而且這種作用隨著PTEN過表達(dá)程度的增加,呈現(xiàn)出下降趨勢,但仍維持在較高水平。SMMC-7721和Huh7細(xì)胞中過表達(dá)PTEN后:細(xì)胞的增殖能力呈現(xiàn)下降趨勢;遷移能力在一定水平增加,超過一定程度出現(xiàn)減弱。
  6、TGFβ處理后,肝癌細(xì)胞PTEN的表達(dá)在蛋白水平上調(diào)。實(shí)時定量PCR也證明在轉(zhuǎn)錄水平,TGFβ的作用使細(xì)胞

13、出現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,PTEN的表達(dá)上調(diào)。
  7、干擾PTEN背景下,TGFβ誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT的效應(yīng)減弱。
  8、PTEN影響CDH1轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄活性;TGFβ促進(jìn)PTEN啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性。
  9、PTEN在腫瘤發(fā)生的早期具有抑癌作用。
  10、KPC小鼠自發(fā)生成膽管癌。
  結(jié)論:
  在肝癌發(fā)生的早期,PTEN具有抑制腫瘤發(fā)生的作用。而在肝癌發(fā)生后,PTEN高表達(dá)促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,低表

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