Netrin-1調(diào)控缺氧誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的實驗研究.pdf

1、目的：肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，容易早期發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，這也是其術(shù)后復(fù)發(fā)、療效差的主要原因。腫瘤微環(huán)境（包括氧濃度、細(xì)胞外基質(zhì)、免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞等）是影響腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素，其中缺氧是許多惡性腫瘤（如肝癌、前列腺癌，胰腺癌等）微環(huán)境的一個顯著特點(diǎn)，缺氧越嚴(yán)重提示腫瘤的預(yù)后越差。癌細(xì)胞主要通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化獲得侵襲能力，進(jìn)而突破基底膜發(fā)生轉(zhuǎn)移。本課題在研究缺氧對肝癌細(xì)胞EMT的誘導(dǎo)作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究缺氧環(huán)境中Netrin-1促進(jìn)肝癌

2、細(xì)胞EMT的作用，并對其下游作用機(jī)制進(jìn)行了深入探討。
　　 方法：通過1%O2低氧培養(yǎng)建立人肝癌細(xì)胞物理缺氧模型，缺氧條件下無血清培養(yǎng)72小時，倒置顯微鏡觀測肝癌細(xì)胞在缺氧條件下的形態(tài)改變，應(yīng)用Western blot方法檢測上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin的表達(dá)變化，羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽檢測細(xì)胞內(nèi)骨架重組，用Transwell檢測缺氧肝癌細(xì)胞遷移、侵襲能力。ELISA檢測缺氧肝癌細(xì)胞分泌的

3、Netrin-1，免疫熒光檢測Netrin-1在缺氧肝細(xì)胞中的表達(dá)。構(gòu)建針對Netrin-1 mRNA的干擾質(zhì)粒pshRNA-Netrin-1及陰性對照質(zhì)粒pGensil-2，測序鑒定重組體。干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞細(xì)胞，G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，RT-PCR和Western blot檢測Netrin-1表達(dá)的變化。缺氧條件下檢測轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞形態(tài)改變、標(biāo)志蛋白蛋白改變和功能改變。構(gòu)建Netrin-1真核表達(dá)質(zhì)粒，酶切鑒定，G418篩選穩(wěn)定

4、轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。觀測過表達(dá)Netrin-1對肝癌細(xì)胞形態(tài)和遷移、侵襲能力的影響。同時給予Netrin-1蛋白作用肝癌細(xì)胞觀測其對肝癌細(xì)胞形態(tài)和遷移、侵襲能力的影響。免疫熒光觀測p-Akt在缺氧肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，Western blot檢測缺氧條件下PI3K/Akt通路信號分子的表達(dá)，觀測PI3K抑制劑LY294002對缺氧誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT的影響。
　　 結(jié)果：在缺氧條件下，肝癌細(xì)胞由連接緊密的上皮樣變成連接松散的紡錘體樣，胞體狹長

5、，細(xì)胞分散，失去細(xì)胞間連接。Western blot結(jié)果顯示，缺氧條件下E-cadherin表達(dá)下降甚至消失，Vimentin表達(dá)顯著增加。鬼筆環(huán)肽檢測顯示，常氧條件下細(xì)胞包內(nèi)F-actin主要位于細(xì)胞周邊，可見纖細(xì)的中間絲，缺氧培養(yǎng)后可見F-actin骨架重組，細(xì)胞周邊的F-actin重新排列成較粗的中間絲（緊張絲），緊張絲在細(xì)胞內(nèi)平行排列拉伸細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞遷移實驗結(jié)果顯示，缺氧顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞遷移能力（P<0.01），侵襲實驗

6、結(jié)果與遷移實驗結(jié)果一致。肝癌細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pshRNA-Netrin-1后，Netrin-1表達(dá)顯著下降，抑制率達(dá)72.79%%±5.11%。轉(zhuǎn)染pshRNA-Netrin-1肝癌細(xì)胞顯著抑制缺氧誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞形態(tài)改變，同時抑制Vimentin表達(dá)，增加E-cadherin表達(dá)，對缺氧促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移能力有顯著抑制作用，透膜細(xì)胞數(shù)（314±21）個較對照組（386±23）個顯著降低（P<0.05），侵襲實驗結(jié)果與遷移實驗結(jié)果一致。常氧條件下

7、，轉(zhuǎn)染Netrin-1真核表達(dá)質(zhì)粒和用500ng/ml Netrin-1作用肝癌細(xì)胞，都觀測到細(xì)胞形態(tài)，呈紡錘體樣，細(xì)胞遷移、侵襲能力顯著增加。PI3K/Akt信號通路在缺氧條件下激活，p-Akt、NF-κB、Twist表達(dá)顯著增加，在LY 294002的作用下，缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)改變和E-cadherin減少均受顯著抑制，LY 294002抑制PI3K信號能阻斷缺氧誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞EMT。
　　 結(jié)論：缺氧環(huán)境中，Netrin-