耐藥結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因rpoB和katG突變分析研究.pdf

1、目的：研究天津市耐藥結(jié)核分枝桿菌rpoB和katG基因的突變情況。籍以探討結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平和異煙肼的耐藥分子機(jī)制。 方法：60株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株來源于天津市結(jié)核病控制中心參比實(shí)驗(yàn)室，包括2005年7月份到2006年4月份期間的所有耐利福平和(或)異煙肼的50株存檔菌株和2006年1月到2月份的10株對(duì)利福平和異煙肼均敏感的存檔菌株，藥敏試驗(yàn)采用用BACTEC MGIT960系統(tǒng)。菌種鑒定采用PNB和TCH生長實(shí)驗(yàn)。用P

2、CR法擴(kuò)增上述菌株的rpoB和katG基因片段，SSCP法分析該基因片段的突變情況，膜反向斑點(diǎn)雜交法確定其突變位點(diǎn)、對(duì)部分菌株的rpoB和katG的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，驗(yàn)證其突變位點(diǎn)情況。以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)敏感株H37Rv為對(duì)照。 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)60株菌株包括利福平耐藥株27株，敏感株33株；異煙肼耐藥株43株，敏感株17株。 1.rpoB基因突變結(jié)果采用PCR擴(kuò)增60株結(jié)核分枝桿菌的rpoB基因，均產(chǎn)生305bp的DNA

3、片段，用SSCP方法檢測該片段，33株利福平敏感株除1株SSCP圖譜與H37Rv不同外其它均相同，27株利福平耐藥株中7株SSCP圖譜與H37Rv不同。利福平耐藥株的突變檢出率為26％(7/27)。 采用PCR擴(kuò)增上述7株利福平耐藥突變株的rpoB基因，均產(chǎn)生2401Dp的DNA片段，用膜反向斑點(diǎn)雜交檢測以上片段，4株531位TCG→TTG(Ser→Leu)，1株526位CAC→TAG(His→Tyr)，1株516位GAC→GG

4、C(Asp→Gly)和533位CTG→CCG(Leu→Pro)聯(lián)合突變，1株膜反向斑點(diǎn)雜交未見突變，經(jīng)測序?yàn)?26位CAC→CGC(His→Arg)，在rpoB基因的81bp的RRDR區(qū)域共發(fā)現(xiàn)4個(gè)位點(diǎn)5種突變類型。 2.katG基因突變結(jié)果采用PCR擴(kuò)增60株結(jié)核分枝桿菌的katG基因，除1株異煙肼耐藥株擴(kuò)增陰性外，均產(chǎn)生273bp的DNA片段。用SSCP方法檢測上述DNA片段，17株異煙肼敏感株SSCP圖譜與H37Rv相同，

5、42株異煙肼耐藥株17株SSCP圖譜與H37Rv不同。異煙肼耐藥株的突變檢出率為42％(18/43)。采用PCR擴(kuò)增上述17株異煙肼耐藥突變株的katG基因，均產(chǎn)生273 bp的DNA片段。用膜反向斑點(diǎn)雜交法檢測以上片段，13株315位AGC→ACC(Ser→Thr)；1株315位AGC→AAC(Ser→Asn)；2株只能判定315位突變，后經(jīng)測序分別突變?yōu)锳CG(Thr)、ACA(Thr)；1株膜反向斑點(diǎn)雜交未見突變，后經(jīng)測序位306