河北省結(jié)核分枝桿菌臨床分離株基因分型、表型耐藥及耐藥相關(guān)基因突變特征研究.pdf

1、目的：初步探討結(jié)核分枝桿菌散在重復(fù)單位-數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列（Mycobacterialinterspersedrepetitiveunits-variablenumbertandemrepeats，MIRU-VNTR）技術(shù)和間隔區(qū)寡核苷酸（Spaceroligonucleotidetyping，Spoligotyping）技術(shù)在河北省結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）臨床分離株的分子流行病學(xué)研究

2、中的應(yīng)用，初步了解河北省MTB臨床分離株的基因型及其分布特征；通過藥物敏感試驗(yàn)和耐藥基因測(cè)序，初步了解河北省MTB臨床分離株的耐藥情況，探討表型耐藥與耐藥相關(guān)基因突變之間、基因型與表型耐藥之間以及基因型與耐藥相關(guān)基因突變之間的相關(guān)性，評(píng)價(jià)耐藥相關(guān)基因位點(diǎn)檢測(cè)對(duì)MTB表型耐藥的臨床診斷價(jià)值，為建立耐藥結(jié)核分枝桿菌分子生物學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：從2014年1月至2014年12月，共收集到1017株河北省MTB臨床分離

3、株及相應(yīng)的病例背景資料。采用PNB/TCH鑒別培養(yǎng)基和多位點(diǎn)PCR進(jìn)行菌種鑒定，采用L-J固體培養(yǎng)基比例法進(jìn)行一線抗結(jié)核藥物（異煙肼、利福平、鏈霉素和乙胺丁醇）的藥物敏感試驗(yàn)，采用15位點(diǎn)MIRU-VNTR和Spoligotyping進(jìn)行基因分型研究，采用基因測(cè)序技術(shù)對(duì)7個(gè)耐藥相關(guān)基因位點(diǎn)（rpsL、rrs、katG、inhA、oxyR-ahpC間隔區(qū)、rpoB和embB）進(jìn)行序列分析，采用BioNumerics5.0軟件進(jìn)行聚類分析、

4、GraphPadPrism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　　1、河北省MTB菌株對(duì)四種一線抗結(jié)核藥物的總耐藥率為34.1％，MDR總耐藥率為13.2%。初始耐藥率為26.6%，初始MDR耐藥率為6.1%；獲得性耐藥率59.7%，獲得性MDR耐藥率為37.6%。獲得性耐藥率和獲得性MDR耐藥率均分別顯著高于初始耐藥率和初始MDR耐藥率（P值均<0.0001）。
　　2、河北省結(jié)核分枝桿菌表現(xiàn)出高度的基因多態(tài)性。S

5、poligotyping顯示，北京家族占90.5%，非北京家族占9.5%。非北京家族以T基因型為主，也發(fā)現(xiàn)了LAM、MANU、H、U等基因型。MIRU-VNTR將1017株MTB菌株分成16個(gè)基因群，共846種VNTR基因型。Spoligotyping和15位點(diǎn)MIRU-VNTR的HGDI值分別為0.279和0.999。
　　3、北京家族與非北京家族在患者年齡、性別、治療史及表型耐藥的分布方面均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。北京家族菌株的成簇率顯

6、著高于非北京家族菌株的成簇率（P<0.0001）。rpsL、embB基因在北京家族菌株中的突變率顯著高于其在非北京家族菌株中的突變率（P值分別為0.0051和0.0180）。
　　4、rpsL基因43位點(diǎn)的突變率為56.0%；rrs基因的突變率為17.0%；katG基因315位點(diǎn)的突變率為62.3%；inhA基因-15位點(diǎn)的突變率為14.1%；oxyR-ahpC間隔區(qū)的突變率10.5%；rpoB基因531位點(diǎn)的突變率為53.7%；

7、embB基因306位點(diǎn)的突變率為56.5%。
　　5、隨著耐藥種類的增加，rpsL43、katG315、rpoB526/531和embB306位點(diǎn)的突變率呈遞增的趨勢(shì)（趨勢(shì)P值均<0.0001）。rpsL43、katG315、rpoB526/531和embB306在MDR菌株中的突變率均顯著高于在非MDR菌株中的突變率（P值分別為0.0136、<0.0001、<0.0001和<0.0001）。rpoB526/531和embB306

8、聯(lián)合檢測(cè)MDR表型耐藥的靈敏度為83.2%，特異度為80.8%。
　　結(jié)論：
　　1、河北省MTB菌株對(duì)一線抗結(jié)核藥物的總耐藥率及MDR耐藥率與全國(guó)平均水平相當(dāng)。MTB菌株耐藥性的產(chǎn)生與抗結(jié)核藥物治療有關(guān)。
　　2、河北省結(jié)核分枝桿菌存在明顯的基因多態(tài)性，北京家族為主要流行株。15位點(diǎn)MIRU-VNTR基因分型法的分辨能力高于spoligotyping基因分型法的分辨能力。15位點(diǎn)MIRU-VNTR和spoligoty

9、ping相結(jié)合，能夠準(zhǔn)確全面地分析河北省結(jié)核分枝桿菌的基因多態(tài)性。
　　3、北京家族菌株在河北省的近期傳播能力比非北京家族更強(qiáng)。rpsL和embB基因突變與北京家族菌株有關(guān)，提示鏈霉素和乙胺丁醇對(duì)北京家族菌株的臨床治療效果可能較差，這種適應(yīng)性代價(jià)使北京家族菌株能夠更好地適應(yīng)環(huán)境，從基因水平解釋了北京家族菌株廣泛傳播的原因。
　　4、rpsL43、katG315、rpoB526/531和embB306位點(diǎn)的突變率隨耐藥種類增加