新型乙型肝炎病毒載體的構(gòu)建及初步應(yīng)用研究.pdf

1、乙型肝炎病毒（HBV）載體是近幾年新發(fā)展的一種病毒載體，不僅具有天然嗜肝特異性，而且具備改造為肝靶向性基因治療載體的基本條件。主要包括：在肝細(xì)胞內(nèi)持續(xù)復(fù)制、反復(fù)感染，病毒本身對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性；能夠攜帶外源基因并被包裝成病毒顆粒；能夠介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移和表達(dá)；但由于基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前改造的HBV載體均存在載容量小、復(fù)制包裝效率低及安全性差等缺點(diǎn)，而且HBV載體制備困難，感染效率低，為解決目前存在的困難，有必要使其與其他病毒載體聯(lián)合

2、應(yīng)用。如與腺病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體聯(lián)合應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)高載容量、高轉(zhuǎn)染效率、高復(fù)制能力，充分發(fā)揮HBV載體嗜肝導(dǎo)向性，可以利用體內(nèi)野生型HBV為之提供包裝，在體內(nèi)形成具有抗HBV作用的HBV樣顆粒，或攜帶治療性目的基因，進(jìn)一步感染其他肝細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)放大效應(yīng)。因此，通過(guò)病毒載體之間的重組，拓寬了HBV載體應(yīng)用領(lǐng)域，不僅有望用于抗HBV基因治療，也可以用于制備DNA疫苗、篩選抗病毒藥物或通過(guò)攜帶外源性標(biāo)志基因用于HBV分

3、子生物學(xué)研究等。本研究通過(guò)構(gòu)建新型的HBV載體表達(dá)不同的目的基因，構(gòu)建了持續(xù)分泌表達(dá)BsdR重組HBV的的細(xì)胞系，用于HBV的分子生物學(xué)研究或篩選HBV易感細(xì)胞系；或與腺病毒載體聯(lián)合構(gòu)建了表達(dá)MMP8等目的基因的質(zhì)粒，用于抗肝硬化的基因治療，為HBV的分子生物學(xué)研究和肝硬化的生物治療等開(kāi)辟了新途徑。
　　 第一部分新型HBV載體的構(gòu)建
　　 目的:應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)改造HBV載體，阻斷其結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，提高HBV載體作為

4、基因治療載體的安全性，使其更適用于作為基因治療載體。
　　 方法：
　　 1.pCH-M5-GFP質(zhì)粒的構(gòu)建通過(guò)改變pCH-S-GFP的起始密碼子或添加終止密碼子，刪除了HBV質(zhì)粒中Core、HBV-DNAP、pre-S1、pre-S2、S and X等結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)，構(gòu)建pCH-M5-GFP質(zhì)粒。
　　 2.pCH-S-hRLuc和pCH-M5-hRLuc的構(gòu)建在pCH-S-GFP和pCH-M5-GFP質(zhì)粒S基

5、因區(qū)，以hRLuc替換GFP，構(gòu)建pCH-S-hRLuc和pCH-M5-hRLuc兩個(gè)質(zhì)粒。
　　 3.外源基因的表達(dá)能力的檢測(cè) HBV載體經(jīng)基因改造后，通過(guò)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞，應(yīng)用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，應(yīng)用熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)海腎熒光素酶的表達(dá)水平，鑒定新構(gòu)建質(zhì)粒pCH-M5-GFP、pCH-S-hrLuc和pCH-M5-hrLuc的外源基因的表達(dá)能力。
　　 4.重組HBV復(fù)制能力的檢測(cè)。與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染

6、后，提取細(xì)胞裂解液中的HBVDNA，Sorthern blot技術(shù)檢測(cè)重組HBV復(fù)制能力。
　　 5.重組HBV感染樹(shù)鼩肝細(xì)胞能力的檢測(cè)。原代培養(yǎng)樹(shù)鼩肝細(xì)胞，感染濃縮的重組HBV顆粒1W后，觀察細(xì)胞內(nèi)GFP的表達(dá)水平。
　　 結(jié)論：HBV載體通過(guò)變更起始密碼子和終止密碼子后，阻斷結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，在S基因區(qū)插入報(bào)告基因GFP和hrLUC，構(gòu)建了新質(zhì)粒，其外源基因的表達(dá)水平高于對(duì)照原始載體質(zhì)粒，能夠形成HBV DNA復(fù)制中間體

7、，而且形成的重組HBV能夠感染樹(shù)鼩肝細(xì)胞。
　　 第二部分新型HBV載體應(yīng)用一：持續(xù)分泌表達(dá)BsdR的重組HBV細(xì)胞系的構(gòu)建
　　 目的：構(gòu)建一個(gè)持續(xù)分泌重組HBV的細(xì)胞系，該重組HBV表達(dá)殺稻瘟菌素抗性基因（BsdR）。
　　 方法：
　　 1.構(gòu)建具有G418抗性的無(wú)包裝信號(hào)的HBV輔助質(zhì)粒pcDNA3.1-CH3142與表達(dá)BsdR的HBV載體質(zhì)粒。
　　 2.上述2個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)

8、胞，經(jīng)G418和殺稻瘟菌素共篩選，獲得陽(yáng)性細(xì)胞克隆。
　　 3.經(jīng)過(guò)ELISA和斑點(diǎn)雜交技術(shù)篩選出高分泌重組HBV-Bsd顆粒的細(xì)胞系。
　　 4.G418反復(fù)加壓培養(yǎng)，Southern blot和Native Western blot技術(shù)，再次篩選，獲得高表達(dá)Bsd的重組HBV的細(xì)胞系，并通過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)重組HBV的表達(dá)水平。
　　 5.應(yīng)用PCR技術(shù)，對(duì)野生型HBV和重組HBV進(jìn)行鑒定，證實(shí)所構(gòu)建細(xì)胞系無(wú)野

9、生型HBV形成。
　　 6.應(yīng)用免疫電鏡技術(shù)觀察到完整的有囊膜包被的重組HBV顆粒。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)BsdR重組HBV的細(xì)胞系，實(shí)現(xiàn)了大量制備重組HBV載體，有助于HBV載體用于HBV易感細(xì)胞系的篩選。
　　 第三部分新型HBV載體質(zhì)粒應(yīng)用二：腺病毒-HBV嵌合載體表達(dá)膠原酶Ⅱ抗肝硬化研究
　　 一、腺病毒-HBV嵌合載體的構(gòu)建與表達(dá)
　　 目的:應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建表達(dá)MMP8、

10、tMMP8、RFP2的HBV載體，再利用復(fù)制缺損型腺病毒載體進(jìn)行包裝，構(gòu)建Ad-CH-tMMP8、Ad-C-MMP8、Ad-CH-RFP2三個(gè)質(zhì)粒。通過(guò)RT-PCR技術(shù)或熒光顯微鏡，觀察細(xì)胞內(nèi)MMP8及tMMP8 mRNA和RFP的表達(dá)情況，證明目的基因的表達(dá)能力。
　　 方法：
　　 1.應(yīng)用PCR技術(shù)和酶切重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)MMP8、tMMP8、RFP2的HBV載體，經(jīng)過(guò)酶切鑒定和測(cè)序鑒定正確后，再利用復(fù)制缺損型腺病毒

11、載體進(jìn)行包裝，構(gòu)建Ad-CH-tMMP8、Ad-C-MMP8、Ad-CH-RFP2三個(gè)質(zhì)粒。
　　 2.PCR技術(shù)證實(shí)重組腺病毒載體正確性，獲得理想基因片段。
　　 3.正確后，進(jìn)行大量提取，純化，濃度測(cè)定，感染293細(xì)胞，進(jìn)行空斑形成能力的檢測(cè)。
　　 4.肝細(xì)胞感染重組腺病毒后，觀察細(xì)胞內(nèi)MMP8及tMMP8 mRNA的表達(dá)情況，應(yīng)用熒光顯微鏡RFP的表達(dá)情況.
　　 5.HBV載體在血管上皮細(xì)胞（E

12、CV304）中低表達(dá)：以CMV啟動(dòng)子及HBVS啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染血管上皮細(xì)胞及肝癌細(xì)胞，分別觀察其GFP的表達(dá)。
　　 結(jié)論：表達(dá)不同目的基因的腺病毒載體-HBV的嵌合載體能夠被成功構(gòu)建。該載體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后，能夠成功表達(dá)各種目的基因；重組腺病毒載體攜帶MMP8基因的質(zhì)粒感染HepG2后，其細(xì)胞中存在MMP8 mRNA的表達(dá)，應(yīng)用熒光顯微鏡可以觀察到紅色熒光蛋白；HBV載體s啟動(dòng)子驅(qū)使的GFP在ECV304中低表達(dá)，在

13、HepG2呈現(xiàn)高表達(dá)。而CMV啟動(dòng)子驅(qū)使的GFP在ECV304和HepG2均呈現(xiàn)高表達(dá)，提示S啟動(dòng)子的載體質(zhì)粒對(duì)肝癌細(xì)胞系有一定特異性。
　　 二、硫代乙酰胺誘導(dǎo)的大鼠肝硬化模型的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:研究HGF/C-met系統(tǒng)在肝硬化發(fā)生和轉(zhuǎn)歸過(guò)程中的表達(dá)水平，探討其逆轉(zhuǎn)纖維化的作用機(jī)制。
　　 方法：42只雄性Wistar大鼠應(yīng)用硫代乙酰胺飲用水喂養(yǎng)，制備肝硬化模型。模型制備成功后，隨機(jī)分為7組，每組6只。每

14、隔2周處死一組大鼠，留取血清檢測(cè)肝功能，并檢測(cè)肝組織中羥脯氨酸含量，進(jìn)行HE和天狼猩紅染色，同時(shí)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)HGF及其受體c-Met，另以正常大鼠6只為對(duì)照。
　　 結(jié)論：應(yīng)用TAA20周成功誘導(dǎo)了肝硬化模型；停止TAA后，肝組織學(xué)、肝功能和肝臟的羥脯氨酸均有不同程度的自愈趨勢(shì)。肝臟組織學(xué)的好轉(zhuǎn)晚于肝功能的變化。在肝組織自愈的的同時(shí)，HGF及其受體c-Met的表達(dá)水平均有不同程度的下降趨勢(shì)，但各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

15、>　　 三、腺病毒-HBV嵌合載體表達(dá)膠原酶Ⅱ治療肝硬化的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:通過(guò)利用腺病毒-HBV嵌合載體，表達(dá)膠原酶Ⅱ，治療肝硬化大鼠模型，探討其能否有效地降解Ⅰ型膠原，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，改善肝功能，逆轉(zhuǎn)肝硬化。
　　 方法：
　　 1.模型制備應(yīng)用0.3％硫代乙酰胺飲用水誘導(dǎo)的方法，制備大鼠肝硬化模型。
　　 2.分組給藥120只肝硬化模型大鼠隨機(jī)分四組，每組30只，分別給予Ad-CH-tMMP8

16、、Ad-C-MMP8、Ad-CH-RFP2三種重組腺病毒尾靜脈注射，以1.5×1011VP/Kg劑量，一次給藥。另外留取30只大鼠作為正常對(duì)照組，給予正常應(yīng)用水喂養(yǎng)。
　　 3.標(biāo)本留取分別于2W、4W、8W后頸椎脫髓法處死動(dòng)物。分離血清，-20℃保存；留取肝組織，少部分用10％的福爾馬林固定，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，余者無(wú)菌條件下保存在液氮中。
　　 4.指標(biāo)檢測(cè)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能、放射免疫法檢測(cè)肝硬化指標(biāo)。胃酸酶

17、解法檢測(cè)肝組織羥脯氨酸含量。HE、天狼星紅染色、免疫組化的方法觀察肝臟組織病理學(xué)改變，并進(jìn)行Knodel評(píng)分和一型膠原所占面積百分比進(jìn)行半定量分析。RT-PCR方法檢測(cè)肝組織內(nèi)MMP8、HGF、c-Met和GAPDH。
　　 5.統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。
　　 結(jié)論：應(yīng)用重組腺病毒治療大鼠肝硬化模型后，肝功能好轉(zhuǎn)，肝組織學(xué)及肝組織內(nèi)的羥脯胺酸明顯改善，肝組織表達(dá)MMP8，能夠有效地降解Ⅰ型膠原，肝硬