INTS10蛋白抑制乙型肝炎病毒復(fù)制的分子機(jī)制的初步研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生健康問題。全球約有3.5億人感染HBV，每年約有100萬人死于乙型肝炎及其并發(fā)癥。HBV感染的慢性化（持續(xù)性感染）有可能引起肝細(xì)胞持續(xù)性損害和肝纖維化，進(jìn)一步發(fā)展成為肝硬化和肝細(xì)胞癌。病毒與宿主的相互作用決定著病毒感染的清除或持續(xù)性感染的建立。與此相一致的是，已有研究表明宿主因素在HBV持續(xù)性感染中發(fā)揮作用。本室前期針對(duì)HBV持續(xù)性感染開展了一項(xiàng)大規(guī)模的

2、全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-wide associationstudy，GWAS)，發(fā)現(xiàn)人類染色體8p21.3區(qū)域是HBV持續(xù)性感染的易感基因組區(qū)域，INTS10基因是HBV持續(xù)性感染的候選易感基因。
　　在本研究中，我們?cè)谌烁渭?xì)胞系中通過過表達(dá)和敲低實(shí)驗(yàn)對(duì)INTS10抗HBV感染的功能進(jìn)行了初步的探索。首先在整合了INTS10或其對(duì)照質(zhì)粒的永生化人肝細(xì)胞系L-02和人肝癌細(xì)胞系HepG2中轉(zhuǎn)染pAAV-HBV1.2復(fù)制型質(zhì)粒

3、，72小時(shí)后收集細(xì)胞及上清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照空質(zhì)粒相比，過表達(dá)INTS10可顯著下調(diào)HBV復(fù)制中間體DNA的水平和HBV RNA的表達(dá)水平，以及降低HBsAg、HBeAg抗原的分泌水平。除了L-02和HepG2細(xì)胞系之外，我們還在因穩(wěn)定整合HBV基因組而組成性產(chǎn)生HBV的人肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15細(xì)胞中同時(shí)整合了INTS10或其對(duì)照質(zhì)粒，相等細(xì)胞數(shù)鋪板，72小時(shí)后收集細(xì)胞及上清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照空質(zhì)粒相比，在Hep

4、G2.2.15細(xì)胞中過表達(dá)INTS10同樣可顯著下調(diào)HBV復(fù)制中間體DNA的水平和HBV RNA的表達(dá)水平，但是HBsAg、HBeAg抗原的分泌水平則沒有發(fā)生顯著變化。隨后我們?cè)贚-02、HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中干擾內(nèi)源性INTS10的表達(dá)，檢測(cè)內(nèi)源性INTS10的表達(dá)變化對(duì)HBV復(fù)制的影響。結(jié)果顯示，在L-02、HepG2細(xì)胞中，下調(diào)內(nèi)源性INTS10的表達(dá)可顯著增強(qiáng)HBV DNA的復(fù)制、HBV RNA的轉(zhuǎn)錄及HBsAg

5、、HBeAg抗原的分泌水平。在HepG2.2.15細(xì)胞中下調(diào)內(nèi)源性INTS10的表達(dá)同樣增強(qiáng)了HBV DNA的復(fù)制、HBV RNA的表達(dá)，但是對(duì)HBsAg、HBeAg抗原的分泌卻無影響?？傊?，上述研究結(jié)果證明INTS10在抗HBV復(fù)制過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　接下來，我們進(jìn)一步探索INTS10抗HBV復(fù)制的分子機(jī)制。INTS10是整合因子復(fù)合體(Integrator complex)家族中的一員。整合因子復(fù)合體參與小核RNA的

6、加工，對(duì)mRNA前體的剪接至關(guān)重要，能夠影響mRNA的持續(xù)合成能力和表達(dá)水平。但是，整合因子復(fù)合體如何在HBV感染過程中發(fā)揮作用尚未見報(bào)道。為了尋找INTS10發(fā)揮抗HBV作用的潛在機(jī)制，我們首先采用高通量基因芯片技術(shù)檢測(cè)了31例HBV相關(guān)肝組織樣本的mRNA表達(dá)譜，然后按照INTS10的表達(dá)水平分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，并尋找在兩組之間存在差異表達(dá)的基因，最后使用DAVID工具對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行通路富集分析。結(jié)果顯示，剪接體信號(hào)通路

7、(spliceosome signalingpathway)和維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ樣受體信號(hào)通路(retinoic acid-inducible gene-Ⅰ-like receptor，RLR)與INTS10的表達(dá)顯著相關(guān)(P值分別為1.5×10-5和1.8×10-3)。
　　剪接體與HBV感染的研究尚未見報(bào)道，但是已有研究顯示RLR信號(hào)通路的成員維甲酸誘導(dǎo)基因-Ⅰ(retinoic acid-inducible gene-Ⅰ，RI

8、G-Ⅰ)和黑色素瘤分化相關(guān)基因5（melanoma differentiation-associated gene5，MDA-5）可以感知HBV和激活機(jī)體固有免疫反應(yīng)來抑制HBV的復(fù)制。為此我們將機(jī)制研究聚焦到RLR通路，推測(cè)INTS10是通過RLR信號(hào)通路來抑制HBV的復(fù)制。
　　為了證實(shí)我們的推測(cè)，首先在L-02、HepG2細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染PLV-INTS10-EGFP質(zhì)粒和pAAV-1.2HBV質(zhì)?；蚯玫图?xì)胞內(nèi)源性INTS10同

9、時(shí)轉(zhuǎn)染pAAV-1.2HBV質(zhì)粒，72小時(shí)后收集細(xì)胞，進(jìn)行蛋白提取，來驗(yàn)證INTS10對(duì)RLR通路相關(guān)基因的影響。而在HepG2.2.15細(xì)胞中則只需過表達(dá)PLV-INTS10-EGFP質(zhì)?；蚯玫图?xì)胞內(nèi)源性INTS10，72小時(shí)后收集細(xì)胞提取蛋白，同樣進(jìn)行RLR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的檢測(cè)。Western blot的檢測(cè)結(jié)果表明，過表達(dá)INTS10，IRF3總蛋白下調(diào)，而p-IRF3(ser396/ser386)則上調(diào)，而p65/p-p65(

10、ser536)、IBαp-IκBα(ser32/36)的表達(dá)則未發(fā)生變化。相反，干擾細(xì)胞內(nèi)源性INTS10表達(dá)后，p-IRF3(ser396/ser386)則下調(diào)，p65/p-p65(ser536)、IκBα/p-IκBα(ser32/36)的表達(dá)也未發(fā)生變化。
　　我們還在L-02、HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中過表達(dá)INTS10或沉默INTS10，觀察ISRE的轉(zhuǎn)錄活性是否發(fā)生改變。報(bào)告基因結(jié)果顯示過表達(dá)INTS10可

11、激活I(lǐng)SRE，敲低INTS10可抑制ISRE的轉(zhuǎn)錄活性。這樣的結(jié)果在L-02、HepG2和HepG2.2.15三個(gè)細(xì)胞系中都得到了一致的驗(yàn)證。下游效應(yīng)分子檢測(cè)結(jié)果顯示，肝細(xì)胞過表達(dá)INTS10后IFN-λ的mRNA表達(dá)水平上調(diào)，沉默肝細(xì)胞內(nèi)源性INTS10后IFN-λ的mRNA表達(dá)下調(diào)。
　　通過Western blot實(shí)驗(yàn)及報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，可初步確定INTS10在抑制HBV復(fù)制的過程中可激活I(lǐng)RF3。為了確定INTS10是依賴于I

12、RF3發(fā)揮抗HBV作用的，我們?cè)贖epG2.2.15細(xì)胞系首先敲低IRF3，36小時(shí)后再過表達(dá)INTS10，72小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞中HBV DNA、HBV RNA及HBsAg、HBeAg的表達(dá)水平。結(jié)果顯示敲低IRF3后再過表達(dá)INTS10，INTS10的抗HBV作用減弱或消失，下游抗病毒效應(yīng)分子IFN-λ的表達(dá)也不再上調(diào)，說明INTS10抵抗HBV復(fù)制是部分通過上調(diào)p-IRF3(ser396)，激活I(lǐng)FN-λ的表達(dá)來起作用的。
　　

13、為了進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證INTS10抑制HBV復(fù)制的功能，我們?cè)?00例HBV感染者的血漿樣本中檢測(cè)了INTS10的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)持續(xù)感染者血漿中INTS10的表達(dá)比自限恢復(fù)者低，且血漿中INTS10的表達(dá)與HBsAg的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。此外，在14例HBV自限恢復(fù)者和40例HBV持續(xù)感染者肝組織樣本的免疫組化結(jié)果顯示，INTS10與p-IRF3的表達(dá)呈正相關(guān)，而與p-p65的表達(dá)則無相關(guān)性。這些來自臨床樣本的實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持了細(xì)胞學(xué)水平的結(jié)果，即