TLR4介導(dǎo)的MyD88信號通路在小鼠腦缺血再灌注損傷中的作用.pdf

1、目的： 缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)損傷是指各種原因造成的局部組織器官的缺血缺氧，使組織細胞發(fā)生缺血性損傷(ischenua injury)，在一定條件下恢復(fù)血液再灌注后，細胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞不但未減輕反而加重的現(xiàn)象。缺血再灌注期間發(fā)生復(fù)雜的病理、生理變化，缺血再灌注可挽救瀕臨死亡的細胞，也可加重細胞損傷，導(dǎo)致細胞死亡。缺血性腦血管病已經(jīng)成為當(dāng)今世界致死、致殘的最主要疾病之一，因此，如何減少

2、腦缺血再灌注損傷是治療腦缺血性疾病過程中急需解決的關(guān)鍵問題。 近來研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注使腦的細胞產(chǎn)生損傷是一個快速的級聯(lián)反應(yīng)，這個級聯(lián)反應(yīng)包括許多環(huán)節(jié)，炎性反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷的重要機制之一。越來越多的報道顯示：即使沒有感染存在，受損及應(yīng)激狀態(tài)細胞發(fā)出的信號也可以引發(fā)免疫反應(yīng)。TLR4(Toll—like receptor4，TLR4)是一種模式識別受體(pattern recognition receptor，PRRs)，

3、能識別病原體，在病原體入侵機體的早期啟動固有免疫，TLR4介導(dǎo)的髓樣分化蛋白MyD88(myeloid differentiation protein88，MyD88)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在抗感染中發(fā)揮重要作用。目前，對TLR4介導(dǎo)的MyD88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究主要集中在抗感染免疫反應(yīng)中。 腦缺血再灌注損傷中炎性反應(yīng)發(fā)揮了重要作用，但TLR4介導(dǎo)的MyD88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腦缺血再灌注損傷中是否被激活而發(fā)揮作用尚未見相關(guān)報道。在抵抗病原體

4、入侵的免疫應(yīng)答啟動過程中TLR4介導(dǎo)的MyD88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能調(diào)節(jié)多種炎癥相關(guān)基因的表達。TLR4被激活后引起自身的二聚化與MyD88結(jié)合，MyD88通過其死域(death domain，DD)與白細胞介素—1受體相關(guān)激酶(IL-1receptor—associated kinase，IRAK)結(jié)合，導(dǎo)致IRAK的自身磷酸化，從而激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因．6(tumor necrosis factorreceptor—associat

5、ed factor6，TRAF6)，使有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen—activated protein kinase，MAPK)家族活化，其中核轉(zhuǎn)錄因子—κB(nuclear factor—κB，NF—κB)誘導(dǎo)激酶激活Ⅰ—κB家族α、β激酶，導(dǎo)致Ⅰ—κB磷酸化而降解，使NF—κB移位到細胞核，啟動TNF-α、IL-1、IL—6等炎性細胞因子的轉(zhuǎn)錄。 本研究旨在觀察小鼠海馬CA1區(qū)和頂葉皮質(zhì)在腦缺血再灌注過程中TLR4

6、介導(dǎo)的MyD88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否被激活；采用TLR4抗體封閉阻斷TLR4受體后，TLR4介導(dǎo)的MyD88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)信號分子、腦組織炎性反應(yīng)及神經(jīng)元損傷的變化情況，探討腦缺血再灌注損傷過程中的分子機制，為臨床減輕腦缺血再灌注損傷提供新的研究和治療方向。 實驗方法： 1、實驗動物的分組 健康昆明種小鼠144只，雌雄兼用，體重18～22克，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，隨機分為3組：(1)假手術(shù)組(S組，n=

7、48)；(2)缺血再灌注組(I組，n—48)；(3) TLR4阻斷組(T組，n=48)。各組又分12h、24h、48h、72h4個時間點。 2、小鼠腦缺血再灌注模型的制備 采用阻斷小鼠兩側(cè)頸總動脈(common carotid arteries，CCA)血流后再實現(xiàn)再灌注的方法。在阻斷雙側(cè)頸總動脈血流后，出現(xiàn)心跳加快、呼吸幅度加深、頻率先加快、后減慢典型生理變化過程的小鼠，作為缺血成功樣本入選。TLR4阻斷組小鼠在右側(cè)頸

8、總動脈內(nèi)注入TLR4抗體(10μg/ml)，缺血再灌注組注射等量生理鹽水，假手術(shù)組只分離雙側(cè)頸總動脈。 3、組織切片的制備 以上各組動物分別于再灌注不同時間點，用多聚甲醛灌注固定，取腦，常規(guī)石蠟包埋，用切片機作連續(xù)腦冠狀切片(片厚7μm)。 4、HE染色觀察海馬、皮質(zhì)組織病理學(xué)變化、圖像分析與統(tǒng)計學(xué)處理 5、海馬CA1區(qū)、頂葉皮質(zhì)神經(jīng)元神經(jīng)病理損傷評分與統(tǒng)計學(xué)處理 6、Western blot檢測

9、海馬、皮質(zhì)TLR4、MyD88、TNF-α，、IL-1β表達、圖像分析及數(shù)據(jù)處理 7、采用TLR4、MyD88原位雜交檢測試劑盒檢測切片TLR4mRNA、MyD88mRNA表達、圖像分析與統(tǒng)計學(xué)處理 8、凝膠電泳遷移率實驗(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)檢測NF—κB結(jié)合活性與統(tǒng)計學(xué)處理 9、免疫組織化學(xué)染色檢測TNF-α、IL-1β表達、圖像分析與統(tǒng)計學(xué)處理

10、 結(jié)論： 1、腦缺血再灌注可激活TLR4，在海馬CA1區(qū)和頂葉皮質(zhì)均出現(xiàn)TLR4過表達，TLR4參與腦缺血再灌注損傷的反應(yīng)機制。 2、TLR4阻斷后可減輕腦組織海馬CA1區(qū)和頂葉皮質(zhì)缺血再灌注神經(jīng)元損傷，提示TLR4參與腦缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)機制。 3、在腦缺血再灌注TLR4激活后，引起其胞內(nèi)銜接蛋白MyD88表達量增加，而采用TLR4抗體阻斷后，MyD88表達量減少。提示TLR4通過上調(diào)MyD88

11、表達參與腦缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)機制。 4、在腦缺血再灌注中NF—κB被激活，并引起炎癥因子IL-1β和TNF-α的過表達，TLR4阻斷后，NF—κB結(jié)合活性明顯降低，炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達也減少；說明TLR4通過上調(diào)NF—κB，IL-1β和TNF-α表達參與腦缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)機制。 5、在腦缺血再灌注中TLR4介導(dǎo)的MyD88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，TLR4阻斷后，可減輕腦缺血再灌注損傷中的炎癥反應(yīng)