蛋白甲基化修飾酶SET7-9對(duì)p53缺失人肺癌細(xì)胞的凋亡效應(yīng)及其機(jī)制.pdf

1、研究背景與目的:
　　SET7/9是蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(protein lysine methyltransferases，PLMTs)家族成員，除了能使組蛋白H3第四位賴氨酸(lysine4 of histone3，H3K4)單甲基化外，更重要的是使一些轉(zhuǎn)錄因子、腫瘤抑制因子、膜相關(guān)受體等非組蛋白單甲基化[1]。p53是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和個(gè)體發(fā)育等生命活動(dòng)。近來(lái)發(fā)現(xiàn)SET7/9能通過(guò)甲基化第372位

2、賴氨酸(K372)調(diào)節(jié)p53穩(wěn)定性，從而影響凋亡[2]。已知包括肺癌在內(nèi)的50％以上的惡性腫瘤存在p53基因異常如缺失或突變，那么在p53缺失的惡性腫瘤細(xì)胞中，SET7/9是否對(duì)凋亡也有影響，如果有又是通過(guò)何種途徑實(shí)現(xiàn)的呢？本項(xiàng)目以p53缺失的人肺癌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象探討了上述問(wèn)題。
　　實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果:
　?。ㄒ唬┯^察SETW9表達(dá)變化對(duì)p53缺失的人肺癌細(xì)胞H1299凋亡的影響。先用將空載質(zhì)粒（Control組）、SET7/

3、9表達(dá)質(zhì)粒（SET7/9組）或SET7/9表達(dá)抑制質(zhì)粒（shRNA-SET7/9組）分別轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞。Western Blot法檢測(cè)SET7/9表達(dá)變化后，用AnnexinV-FITC/PI雙染法與流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞Hoechst33342染色檢測(cè)凋亡率。結(jié)果顯示，與Control組[(12.11±4.41)％]比較，H1299細(xì)胞過(guò)表達(dá)SET7/9后凋亡率[(4.36±0.63)％]明顯降低，而抑制SET7/9表達(dá)則凋亡率[(16

4、.64±1.49)％]升高，表明SET7/9表達(dá)變化對(duì)p53缺失人肺癌細(xì)胞存在凋亡效應(yīng)。
　　（二）觀察SET7/9對(duì)H1299的凋亡效應(yīng)與p53途徑的關(guān)系。在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上共轉(zhuǎn)染野生型p53表達(dá)質(zhì)粒，用或不用阿霉素(Adr)激活p53途徑，相同方法檢測(cè)凋亡率。結(jié)果顯示，野生型p53表達(dá)質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染[(21.70±3.80)％]或加用Adr處理[(24.84±2.11)％]均明顯增加凋亡率;無(wú)論是否與野生型p53表達(dá)質(zhì)粒(p53/

5、pIRES2-Zs1)共轉(zhuǎn)染、且是否在共轉(zhuǎn)染基礎(chǔ)上用Adr處理細(xì)胞以進(jìn)一步激活p53途徑，SET7/9過(guò)表達(dá)均使H1299細(xì)胞凋亡率[Adr處理(10.38±1.46)％ vs(7.80±0.46)％、Adr未處理(7.80±0.46)％ vs(4.36±0.63)％]明顯降低，而SET7/9表達(dá)受抑均增加H1299細(xì)胞凋亡率[Adr處理(29.42±2.83)％ vs(24.32±3.00)％、Adr未處理(24.32±3.00)％

6、vs(16.64±1.49)％]，但shRNA-SET7/9質(zhì)粒與p53表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的效應(yīng)，無(wú)論細(xì)胞是否用Adr處理，均未達(dá)到兩質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染時(shí)誘導(dǎo)凋亡效果之和。這些結(jié)果提示SET7/9與p53對(duì)H1299細(xì)胞凋亡的影響呈非交互的獨(dú)立作用。
　?。ㄈ┎捎肞53缺失的A549人肺癌細(xì)胞重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨于一致，進(jìn)一步證實(shí)SET7/9對(duì)P53缺失的人肺癌細(xì)胞的凋亡效應(yīng)。
　　（四）以H1299細(xì)胞為研究對(duì)象探討SET7/

7、9對(duì)P53缺失人肺癌細(xì)胞凋亡效應(yīng)的分子機(jī)制。Western Blot法檢測(cè)SET7/9表達(dá)變化后轉(zhuǎn)錄因子和凋亡相關(guān)蛋白P21、P65、E2F1等含量，發(fā)現(xiàn)E2F1變化趨勢(shì)與H1299凋亡率變化相同，即SET7/9表達(dá)增加時(shí)E2F1含量減少，凋亡率降低;SET7/9表達(dá)受抑則E2F1含量增加，凋亡率升高。已知SET7/9可甲基化E2F1，促使其泛素化降解，降低E2F1的非p53依賴型途徑激活程度而減少凋亡[3，4]。因此，本研究結(jié)果提示S

8、ET7/9可能通過(guò)E2F1的非p53依賴型途徑調(diào)控P53缺失人肺癌細(xì)胞的凋亡效應(yīng)。
　　結(jié)論:
　　(1) SET7/9表達(dá)變化對(duì)p53缺失的人肺癌細(xì)胞凋亡具有影響，SET7/9表達(dá)增加會(huì)抑制凋亡，SET7/9表達(dá)受抑會(huì)誘導(dǎo)凋亡。
　　(2)這種影響與p53途徑呈非交互的獨(dú)立作用，即非p53途徑依賴性。
　　(3) SET7/9對(duì)p53缺失的人肺癌細(xì)胞凋亡的影響可能是通過(guò)E2F1介導(dǎo)的非p53依賴性凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的