牛蒡子苷對晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導小鼠足細胞轉分化的影響.pdf

1、研究背景：
　　 腎臟纖維化是各種慢性腎臟病(chronickidneydiseases，CKD)的最終歸宿和必然結局，無論是各種原發(fā)性腎小球疾病、糖尿病、輸尿管阻塞，還是腎功能的損害都與腎臟纖維化程度密切相關，纖維化病變迄今無法阻抑或逆轉，因此加強CKD的早期防治，降低終末期腎病(end-stagerenaldisease，ESRD)的發(fā)病率具有十分重要的意義。
　　 足細胞是覆蓋于腎小球基底膜(glomerularb

2、asementmembrane，GBM)外壁的一種終末分化的細胞，其損傷后導致的濾過膜電荷和孔徑屏障的破壞，是蛋白尿形成的主要原因之一。足突之間裂孔膜蛋白的完整性是腎小球濾過屏障的關鍵，這些蛋白的損傷或表達下降都可引起足細胞結構和功能障礙，從而導致蛋白尿的發(fā)生。尿蛋白不僅是腎小球損傷的結果，更是導致腎損傷進展的獨立危險因素。大量尿蛋白在腎小管管腔內聚集可使小管上皮細胞受損，并促進炎性物質釋放，導致炎癥細胞在腎間質內浸潤，加劇腎間質纖維化

3、，引起腎功能進行性減退，最終可能發(fā)展為終末期腎衰竭。Nephrin、Podocin、CD2AP等構成了足細胞裂孔膜蛋白復合體，其中Nephrin是接受及傳遞損傷信號的首要分子，其基因和蛋白表達異常在蛋白尿的發(fā)生機制中起著重要作用，Podocin在維持裂孔膜蛋白復合體的正常結構和功能中起著重要作用。
　　 上皮細胞向間充質細胞轉分化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)現(xiàn)象是發(fā)生于腎臟纖維化早

4、期且可逆的過程，對此過程的研究引起眾多學者的關注。除腎小管上皮細胞可發(fā)生EMT、血管內皮細胞發(fā)生EndoMT(endothelial-to-mesenchymaltransition，EndoMT)外，最新研究表明在TGF-β1作用下腎小球足細胞也可發(fā)生EMT，使足細胞表型改變，喪失足細胞特異性標志、顯現(xiàn)轉分化特征，并表達肌成纖維特有的標志性蛋白α-SMA，引起足細胞及腎小球濾過屏障功能障礙，產(chǎn)生蛋白尿，同時EMT使足細胞獲得基質分泌功

5、能，細胞外基質分泌過多、降解減少，導致腎小球硬化，最終發(fā)展至纖維化。并且臨床研究顯示糖尿病腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)等一些以蛋白尿為主要表現(xiàn)的腎小球病變都伴有明顯的足細胞形態(tài)和功能異常。EMT在腎小球濾過屏障損傷、蛋白尿及腎小球硬化過程中發(fā)揮重要的作用，這為探索足細胞疾病的防治開辟了嶄新的前景。
　　 晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)作為一類促炎癥、促氧化的大分子生物毒素，存在于慢性腎功能衰竭(CRF)患者血漿中，是導致

6、CRF患者免疫功能紊亂、動脈粥樣硬化、透析相關性淀粉樣變等長期并發(fā)癥的重要致病環(huán)節(jié)。研究表明，AOPP不僅是氧化應激的產(chǎn)物，同時也是氧化應激及炎癥反應的執(zhí)行者，在糖尿病及糖尿病高危人群如CKD、肥胖者體內也增高，提示AOPP可能參與糖尿病及糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和進展。陳詠梅等人的實驗證實了AOPP可引起腎小管上皮細胞α-SMA蛋白表達增加。最近YANGLI等通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，AOPP可誘導足細胞特征性的蛋白nephrin、podocy表達

7、減少，并進一步在體內得到證實，且這與足細胞凋亡無關。
　　 內質網(wǎng)是細胞加工蛋白質和儲存Ca2+的主要場所，當細胞對內質網(wǎng)功能的需求超過其自身能力時出現(xiàn)蛋白質的錯誤折疊，或未折疊蛋白在腔內聚集以及ca2+平衡紊亂的狀態(tài)，稱為內質網(wǎng)應激(ERS)，ERS是細胞的一種自我保護機制，適度的ERS可以恢復內質網(wǎng)及內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)、保持細胞活性，但是過強或過長時間的ERS可以誘導一系列細胞因子的大量釋放并且最終導致細胞凋亡。研究證明ERS在動

8、脈粥樣硬化、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病、腫瘤、病毒感染、老化等多種疾病進展中起重要作用，近年研究發(fā)現(xiàn)，ERS參與了一些原發(fā)性腎小球疾病、繼發(fā)性腎小球疾病如糖尿病腎病、藥物/毒物相關性腎小管-間質損傷、腎缺血-再灌注損傷、慢性腎臟病等的發(fā)病機制。Markan等發(fā)現(xiàn)在膜性增生性腎小球腎炎以及急進性腎小球腎炎中Grp78及CHOP蛋白表達水平顯著增高，而抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達水平卻顯著降低，提示在腎小球病變進展過程中，多種有害物刺激誘導了

9、過度ERS，并且又可通過激活凋亡信號途徑觸發(fā)細胞凋亡，導致腎小球的進行性損傷。無論是體外、體內還是活檢病理均提示，足細胞ERS與足細胞損傷相關，并且最近研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺上皮細胞及腎小管上皮細胞ERS可直接導致EMT，因此我們推測AOPP可能通過ERS或氧化應激途徑引起EMT。
　　 中藥在延緩CRF進展方面歷史悠久，有改善腎小球硬化和腎間質纖維化的作用，其中傳統(tǒng)中藥牛蒡子及其提取物牛蒡子苷(Arctiin)能有效減少尿蛋白、保護腎

10、臟，在防治慢性腎臟病中的作用逐漸引起廣泛關注，但其機制尚不清楚。牛蒡子為菊科植物牛蒡的干燥成熟果實，其味辛苦、性寒，歸肺、胃經(jīng)，具有疏散風熱、宣肺祛痰、利咽透疹、解毒消腫等功效。牛蒡子苷是從牛蒡子中提取分離而來的木脂素類化合物，牛蒡子苷在消化道腸菌及肝臟中的兒茶酚-O-甲基轉移酶(COMT)的作用下形成牛蒡子苷元而發(fā)揮作用。研究表明，牛蒡子可通過減少轉化生長因子-β1(TGF-β1)、腎皮質單核趨化蛋白-1(MCP-1)、腫瘤壞死因子(

11、TNF-α)表達，降低腎皮質蛋白激酶C(PKC)活性，影響腎小球細胞外基質(ECM)合成與降解，減輕細胞內蛋白非酶糖基化，增加足細胞固有蛋白nephrin、podocin的表達來發(fā)揮降尿蛋白、保護腎臟的作用。另外牛蒡子在原發(fā)性腎臟病方面的防治作用亦得到認可，有研究發(fā)現(xiàn)牛血清白蛋白誘導的膜性腎小球腎炎模型大鼠，口服牛蒡子苷三周后，血肌酐、血尿素氮、尿蛋白含量顯著降低，內生肌酐清除率顯著升高，纖維蛋白樣壞死、局灶性節(jié)段性增生等腎臟損害參數(shù)發(fā)

12、生逆轉。牛蒡子苷可降低糖尿病大鼠尿蛋白、減輕腎臟肥大、防止糖尿病腎小球硬化、改善糖尿病大鼠腎損害，通過減輕大鼠腎臟的高濾過、高灌注，從而保護腎功能。另外，牛蒡子苷通過抑制TNF-α、NO的大量釋放，從而對于慢性腎炎、腎病綜合征及慢性腎衰均有一定的防治作用。
　　 本實驗通過Westernblotting技術觀察牛蒡子苷對AOPP刺激的小鼠足細胞ERS標志性蛋白Grp78、CHOP以及平滑肌激動蛋白(α-SMA)等表達的影響，探討

13、牛蒡子苷是否可通過減輕ERS從而逆轉EMT，從而為慢性腎臟病的早期防治提供新的實驗依據(jù)。
　　 研究目的：
　　 觀察牛蒡子苷對AOPP誘導小鼠足細胞Grp78、CHOP、α-SMA蛋白表達的影響，探討牛蒡子苷是否可通過減輕ERS從而逆轉小鼠足細胞EMT，為中藥抗腎臟纖維化提供新的研究方向。
　　 研究方法：
　　 1.AOPP的制備:按文獻報道的方法將人血清白蛋白(HSA)與次氯酸溶液以1/140的摩爾

14、比例混合，室溫反應30min(25～30℃)，用PBS透析24小時去除殘留次氯酸，制備的AOPP-HSA加入β-巰基乙醇終止反應，離心超濾30min，加入適量PBS沖洗，再次離心超濾，通過測其OD值(340nm)來測量AOPP含量。
　　 2.通過預實驗可觀察到AOPP刺激小鼠足細胞表達α-SMA蛋白最大效應劑量點為200μg/ml，最佳效應時間點為24小時。
　　 3.根據(jù)實驗目的共分為9組:（1）.MPC5空白對照組

15、;（2）.MPC5＋BSA組;（3）.MPC5＋AOPP組;（4）.MPC5＋AOPP＋Arctiin(50μmol/L)組;（5）.MPC5＋AOPP＋Arctiin(100μmol/L)組;（6）.MPC5＋AOPP＋Arctiin(200μmol/L)組;（7）.MPC5＋AOPP＋Arctiin(400μmol/L)組;（8）.MPC5＋thapsigargin(0.25μmol/L)組;（9）.MPC5＋thapsigargi

16、n(0.25μmol/L)＋Arctiin(400μmol/L)組。
　　 4.各組分別培養(yǎng)24h后采用Westernblotting檢測ERS標志性蛋白Grp78、CHOP以及α-SMA表達水平。
　　 研究結果：
　　 1.Westernblotting測定Grp78、CHOP、α-SMA的蛋白表達水平
　　 觀察1-3組Westernblotting顯示，與空白組及白蛋白組對比，AOPP刺激MPC5

17、細胞24h后可引起Grp78、CHOP、α-SMA蛋白表達均增高(P＜0.05)，提示AOPP可引起ERS和EMT。文獻報道Thapsigargin作為ERS誘導劑，可特異性的作用于內質網(wǎng)，而對其他細胞器無影響，本實驗觀察到毒胡蘿卜素同樣可引起Grp78、CHOP、α-SMA蛋白表達增高。
　　 2.Westernblotting測定Arctiin干預后Grp78、CHOP、α-SMA的蛋白表達水平
　　 200μg/m

18、l的AOPP刺激MPC5細胞24h后可引起Grp78、CHOP、α-SMA蛋白表達增高，而加入Arctiin可逆轉這一現(xiàn)象。隨著Arctiin濃度的增高，Grp78、CHOP、α-SMA蛋白表達呈持續(xù)下降趨勢，且在一定范圍內呈劑量依賴性。當Arctiin濃度達400μmol/L時，Grp78、CHOP、α-SMA表達水平與MPC5＋AOPP組以及50μmol/L牛蒡子苷組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。本實驗還觀察到，牛蒡子苷可

19、逆轉毒胡蘿卜素引起的ERS及α-SMA蛋白表達增高。
　　 研究結論：
　　 本實驗成功觀察到AOPP條件下培養(yǎng)的小鼠足細胞Grp78、CHOP、α-SMA蛋白表達水平明顯升高，用牛蒡子苷作用后，三種蛋白表達水平持續(xù)降低，且呈劑量依賴性，證實了AOPP可能通過引起小鼠足細胞ERS從而導致EMT，同時也證實了牛蒡子苷可以下調AOPP及毒胡蘿卜素刺激后引起的Grp78、CHOP、α-SMA的蛋白表達水平，說明牛蒡子苷則可通過