晚期氧化蛋白產(chǎn)物通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞肥大及轉(zhuǎn)分化.pdf

1、研究目的：
　　本研究的主要目的是探討AOPPs是否可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞肥大和發(fā)生EMT，并研究ERS是否是AOPPs誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞肥大和發(fā)生EMT的主要細(xì)胞內(nèi)機(jī)制之一。此外，本研究還探討了氧化應(yīng)激是否參與了此過程及與ERS的關(guān)系。本研究的結(jié)果將為早期干預(yù)治療CKD提供新的治療靶點。
　　研究方法：
　　1.AOPP的制備
　　AOPPs牛血清白蛋白按文獻(xiàn)報導(dǎo)配制。次氯酸溶液與血清白蛋白(BSA)以140/1

2、的摩爾比例混合，于室溫下(25～30℃)反應(yīng)30分鐘，以PBS透析24小時去除殘留次氯酸。對照組未經(jīng)修飾的牛血清蛋白直接融入PBS即可。所得樣品用Detoxi-Gel凝膠柱去除內(nèi)毒素。所有制備的AOPP經(jīng)鱟試驗法檢測內(nèi)毒素含量均低于0.25 EU/ml。AOPP含量的測定方法:在酸性條件下340nm處測定溶液的吸光度值，以氯胺T為標(biāo)準(zhǔn)取得。
　　2.實驗細(xì)胞:人近端腎小管上皮細(xì)胞株HK-2的培養(yǎng)
　　HK-2細(xì)胞于美國ATC

3、C庫購買，在37℃、5％CO2條件下的含10％熱滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中孵育。觀察細(xì)胞長至80％以上融合時，以0.25％胰酶消化后接種至6孔培養(yǎng)板繼續(xù)傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞長至70％-80％左右時用于后續(xù)實驗。
　　3.AOPP以濃度依賴的方式誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞肥大和發(fā)生EMT
　　腎小管上皮細(xì)胞分別與50μ g/ml、100μ g/ml、200μ g/ml、400μ g/ml AOPPs共同孵育24小時，50μ g/ml

4、BSA作為陰性對照組，另設(shè)一組HK-2細(xì)胞作為空白對照。收集細(xì)胞樣本，分別采用Western blot檢測CHOP、GRP78、p27、α-SMA、E-cadherin蛋白表達(dá)量及總蛋白含量，Real Time Quantitative PCR(RT-PCR)檢測CHOP、GRP78、p27、α-SMA、E-cadherin的mRNA表達(dá)水平。使用流式細(xì)胞儀來分析細(xì)胞周期分布情況。
　　4.AOPP以時間依賴的方式誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)

5、胞肥大和發(fā)生EMT
　　腎小管上皮細(xì)胞分別與200μ g/ml AOPP、50μ g/ml BSA孵育不同時間(30min、1h、3h、6h、12h、24h)，收集細(xì)胞樣本，采用Western blot檢測CHOP、GRP78、p27、α-SMA、E-cadherin蛋白表達(dá)量及總蛋白含量，以RT-PCR檢測CHOP、GRP78、p27、α-SMA、E-cadherin的mRNA表達(dá)水平。使用流式細(xì)胞儀來分析細(xì)胞周期分布情況。

6、r>　　5.ERS在AOPP誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞肥大和轉(zhuǎn)分化中的作用
　　分別以200μg/ml AOPPs、50μg/ml BSA、50μmol/L salubrinal(ERS抑制劑)、0.25μmol/L thapsigargin(ERS誘導(dǎo)劑)預(yù)處理腎小管上皮細(xì)胞1h后再加入200μg/ml AOPP刺激細(xì)胞，共同孵育24小時。收集各組細(xì)胞樣本，采用Western blot和RT-PCR檢測 CHOP、GRP78、p27、

7、α-SMA、E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)量，以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。
　　6.氧化應(yīng)激在AOPP誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞肥大和轉(zhuǎn)分化中的作用
　　分別以200μ g/ml AOPPs、50μ g/ml BSA、10μ mol/L DPI（NADHP氧化酶抑制劑）或200U/ml SOD（氧自由基清除劑）預(yù)處理腎小管上皮細(xì)胞1h后再加入200μg/ml AOPP刺激細(xì)胞，共同孵育24小時。收集各組細(xì)胞樣本，采用West

8、ernblot和RT-PCR檢測 CHOP、GRP78、p27、α-SMA、E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)量，以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。
　　研究結(jié)果：
　　1.AOPP以劑量時間依賴方式誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞肥大
　　本實驗通過測定HK-2細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量研究AOPPs是否會引起腎小管上皮細(xì)胞肥大。實驗結(jié)果表明AOPP刺激使HK-2細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量顯著增加(Fig.1)。此外，本實驗還檢測了p27的蛋白及mRNA

9、表達(dá)情況以及細(xì)胞周期分布情況。AOPPs刺激以劑量時間依賴性誘導(dǎo)p27蛋白(Fig.2，A&B)及其基因(Fig.2，C&D)過表達(dá)，同時使得G1期細(xì)胞(Fig.2 E&F)百分比增加。盡管AOPP刺激組細(xì)胞培養(yǎng)24h后，細(xì)胞內(nèi)p27蛋白表達(dá)量、總蛋白含量、G1期細(xì)胞數(shù)量均未達(dá)到最高值，但其表達(dá)水平均顯著高于對照組(p＜0.05)。并且上述改變在對照組和未經(jīng)修飾的BSA組均未觀察到。這些實驗結(jié)果表明:p27蛋白過表達(dá)、總蛋白蓄積、G1期

10、細(xì)胞百分比增加均與血清蛋白的晚期氧化有關(guān)。簡言之，本實驗通過觀察AOPPs引起p27過表達(dá)及G1期細(xì)胞百分比增加，說明AOPPs可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞肥大。
　　2.AOPP以劑量時間依賴方式誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化
　　本實驗通過檢測E-cadherin和α-SMA蛋白及mRNA的表達(dá)來觀察AOPPs是否可引起腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。E-cadherin蛋白和mRNA的表達(dá)隨著AOPP刺激濃度的增高和時間的延長而下調(diào)，α-SM

11、A蛋白和mRNA的表達(dá)則隨著AOPP刺激濃度的增高和時間的延長而上調(diào)(Fig.3)。AOPP刺激誘導(dǎo)α-SMA的mRNA表達(dá)水平在12h時上升達(dá)最高峰，24h時下降，但其表達(dá)水平始終顯著高于對照組(P＜0.05)。對照組和未經(jīng)修飾的血清蛋白(BSA)組，E-cadherin和α-SMA蛋白表達(dá)水平無明顯改變，這說明E-cadherin蛋白丟失和α-SMA蛋白過表達(dá)均與血清蛋白的晚期氧化相關(guān)。綜上可知，AOPPs可引起腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化

12、。
　　3.AOPP誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)
　　本實驗通過RT-PCR法和western-blot法檢測GRP78和CHOP蛋白及mRNA表達(dá)水平，研究AOPPs刺激是否可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。與對照組和未修飾BSA組相比，AOPPs刺激組GRP78和CHOP蛋白及其mRNA表達(dá)水平均顯著增高(Fig.4)。盡管AOPP刺激組GRP78和CHOP蛋白及mRNA表達(dá)水平未在24h達(dá)最大值，但其表達(dá)水平始終明顯高于

13、對照組。以上數(shù)據(jù)說明AOPPs可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　4.AOPP通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞肥大及轉(zhuǎn)分化
　　為了研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在AOPP誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞肥大及發(fā)生轉(zhuǎn)分化中的作用，本實驗在各組HK-2細(xì)胞內(nèi)加入試劑如下:第一組為空白對照組，第二組為白蛋白對照組，第三組為200μ g/mLAOPPs刺激組，第四組為AOPPs+salubrinal(可激活eIF2α，減輕細(xì)胞ERS)組，第五組為tha

14、psigargin（細(xì)胞ERS誘導(dǎo)劑）組，經(jīng)RT-PCR法和Western Blot法檢測各組CHOP、GRP78、p27、E-cadherin和α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)情況。AOPP在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平誘導(dǎo)CHOP，GRP78，p27和α-SMA蛋白過表達(dá)，抑制E-cadherin蛋白表達(dá)，上述現(xiàn)象經(jīng)ERS抑制劑處理后可部分逆轉(zhuǎn)，而ERS誘導(dǎo)劑則可直接誘導(dǎo)細(xì)胞上述現(xiàn)象的發(fā)生(Fig.5)。此外，ERS抑制劑可部分抑制AOPP誘導(dǎo)的腎小

15、管上皮細(xì)胞G1期細(xì)胞百分比和總蛋白含量的增加，而ERS誘導(dǎo)劑則引起腎小管上皮細(xì)胞G1期細(xì)胞百分比和總蛋白含量的增加(Fig.6)。所以，本實驗結(jié)果提示AOPP通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞肥大及轉(zhuǎn)分化。
　　5.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與氧化應(yīng)激相關(guān)
　　為研究腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中氧化應(yīng)激的作用，本實驗在各組HK-2細(xì)胞內(nèi)加入試劑如下:第一組為空白對照組，第二組為白蛋白對照組，第三組為200μg/mLAOPPs刺激組，第四組為

16、AOPPs+DPI（NADPH氧化酶抑制劑）組，第五組為AOPPs+SOD（總的活性氧抑制劑）組，經(jīng)RT-PCR法和Western Blot法檢測各組CHOP、GRP78、p27、E-cadherin和α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)情況。實驗結(jié)果提示AOPP可下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，NADPH氧化酶抑制劑和ROS抑制劑可部分逆轉(zhuǎn)AOPP引起的HK-2細(xì)胞總蛋白含量和G1期細(xì)胞百分比的增加(Fig.6)，同時也可抑制AOPP誘導(dǎo)的α

17、-SMA、CHOP和GRP78的過表達(dá)(Fig.5)。綜上所述，本實驗結(jié)果提示氧化應(yīng)激在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的上游或下游通路中起作用，并參與了AOPP誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞肥大及轉(zhuǎn)分化過程。
　　研究結(jié)論：
　　本實驗研究結(jié)果證實晚期氧化蛋白產(chǎn)物可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞肥大及轉(zhuǎn)分化。此外，本實驗結(jié)果提示了氧化應(yīng)激反應(yīng)也參與了AOPP誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞肥大和發(fā)生EMT的過程，且與ERS有關(guān)。本實驗結(jié)果將為早期干預(yù)CKD的進(jìn)展