晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的機制研究.pdf

1、糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是全球范圍內(nèi)引起終末期腎病的首要原因。蛋白尿是DN的主要臨床特征，也是促進DN進展的獨立危險因素，可由腎小球濾過屏障損害所致。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞是腎小球濾過屏障的重要組成部分，在調(diào)節(jié)腎小球濾過率中發(fā)揮著重要的作用。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷可導(dǎo)致腎小球濾過功能的功能失調(diào)，進而導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生。此外，近年來，越來越多研究提示腎小球內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)可促DN的進展。值得注意的是，內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)

2、分化(endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT/EndoMT)，本質(zhì)上可視為上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的一種特殊類型，在內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程及腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，而腎臟纖維化是DN的主要病理特征。EndMT發(fā)生時，內(nèi)皮細(xì)胞失去其特異性標(biāo)志物，如血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1/CD31(plat

3、eletendothelial cell adhesion molecule/cluster of differentiation31,PECAM-1/CD31)、血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)、claudin5等，而重新獲得間充質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物，如成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1（fibroblast specific protein-1，F(xiàn)SP-1）、波形蛋白(v

4、imentin)、和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)等。EndMT這個概念最先出現(xiàn)在胚胎心臟發(fā)育中，但近年來越來越多的研究顯示EndMT在多種腎臟疾病中的腎纖維化過程中起著重要的作用。Zeisberg等學(xué)者利用三種不同的小鼠腎病模型（包括鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病模型），最先報道腎臟纖維化中肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞可能來源于EndMT，而肌成纖維細(xì)胞在腎臟纖維化中發(fā)揮重要作用。隨后，Li等學(xué)者研究證明

5、了EndMT可促進早期DN的腎臟纖維化的發(fā)生及發(fā)展過程。綜上，EndMT可促進DN腎臟纖維化的進展。因此，探討誘導(dǎo)EndMT發(fā)生的機制可能為DN的防治提供新的干預(yù)靶點。然而，目前關(guān)于EndMT發(fā)生的機制仍知之甚少。
　　多種因素可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷。最近研究提示，晚期氧化蛋白產(chǎn)物(advancedoxidation protein products，AOPPs)可通過激活晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptorof advanced

6、glycation end products，RAGE)介導(dǎo)的信號通路激活血管內(nèi)皮細(xì)胞。AOPPs是由Witko-Sarsat等學(xué)者于1996年首次在慢性腎衰患者血漿中發(fā)現(xiàn)的一類尿毒癥毒素，其主要成分是血清白蛋白酪氨酸殘基氧化后形成的蛋白交聯(lián)產(chǎn)物。近年來，越來越多的研究證據(jù)表明AOPPs參與了多種腎臟疾病(包括DN)的發(fā)生發(fā)展的過程。我們課題組最近的研究也證明了AOPPs可誘導(dǎo)人近端腎小管上皮細(xì)胞肥大及發(fā)生EMT。但是，AOPPs是否可

7、誘導(dǎo)EndMT的發(fā)生及其機制目前尚待闡明。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress，ERS)在腎臟病理生理過程中發(fā)揮著重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是由多種因素（如:饑餓、缺氧、病毒感染等）引起的病理生理狀態(tài)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中未折疊或錯誤折疊的蛋白可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進而引起未折疊蛋白反應(yīng)（一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的適應(yīng)性過程）。然而，由過強或持久的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的未折疊蛋白反應(yīng)也可誘發(fā)細(xì)胞凋亡途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)肺上皮細(xì)

8、胞、甲狀腺上皮細(xì)胞、及腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。值得注意的是，研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可導(dǎo)致腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷。但是，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在AOPPs誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程中的作用尚未明確。
　　目的：本研究以體外培養(yǎng)的人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(human renal glomerular endothelialcells，HRGECs)為研究對象，首先，探討AOPPs是否可誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞EndMT的發(fā)生，然后，探討AOPPs是否可誘導(dǎo)人腎小

9、球內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，最后，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否介導(dǎo)了AOPPs誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞EndMT的過程。
　　方法：
　　1.無內(nèi)毒素AOPPs修飾蛋白的制備和鑒定
　　參考文獻方法體外制備AOPPs-BSA。將經(jīng)純化后、無內(nèi)毒素的100 mg/mLBSA與200 mmol/L次氧酸等體積混合后（不含碳水化合物、游離脂肪酸和脂質(zhì)，以排除形成AGEs樣結(jié)構(gòu)），于室溫放置30分鐘后，即可制備出BSA與次氯酸摩爾比為1:1

10、40的AOPPs-BSA。制各的AOPPs-BSA在無菌PBS中透析24小時以去除游離的次氯酸。將100 mg/mL BSA與PBS等體積混合，作為對照。制備的AOPPs和BSA對照均需要經(jīng)過Detoxi-Gel凝膠柱去除內(nèi)毒素。所有制備的AOPPs-BSA和未經(jīng)過修飾的BSA經(jīng)鱟試驗法檢測內(nèi)毒素含量均低于0.025EU/ml。AOPPs含量通過測定酸性條件下340nm的光吸收，以氯胺T為標(biāo)準(zhǔn)取得。通過上述方法所制備的AOPPs-BSA

11、和未經(jīng)修飾的BSA的AOPPs含量分別為65.2±2.12 nmol/mg蛋白和0.2±0.04 nmol/mg蛋白。
　　2.人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)
　　人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞HRGECs細(xì)胞購自美國ScienCell Research Laboratories。細(xì)胞復(fù)蘇后在37℃、5％CO2條件下，用含5％的胎牛血清、1％的內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑(ECGS)及100 U/mL青霉素、100mg/L鏈霉素的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。待

12、細(xì)胞生長至約80％融合時用于進行試驗。本研究用2-5代細(xì)胞進行實驗。人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基靜置細(xì)胞24小時后用于實驗。
　　3.AOPPs誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT
　　人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞分別與AOPPs(50、100、200、及400μg/mL)或未經(jīng)修飾的BSA（200μg/mL）共同孵育24小時，或人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞分別與200μg/mLAOPPs或200μg/mL未經(jīng)修飾的BSA共同孵育12、24、48小

13、時，實時熒光定量PCR法檢測內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志性物CD31、VE-cadherin、claudin5和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性物FSP-1、α-SMA、及vimentin的mRNA表達水平
　　4.AOPPs激活人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
　　人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞分別與AOPPs(50、100、200、及400μg/mL)或未經(jīng)修飾的BSA(200μg/mL)共同孵育24小時，或人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞分別與200μg/mLAOPPs或200μg/m

14、L未經(jīng)修飾的BSA共同孵育12、24、48小時，實時熒光定量PCR法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白GRP78和CHOP的mRNA表達水平
　　結(jié)果：。
　　1.AOPPs誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT
　　為了探討AOPPs是否可誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT，我們將人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞與AOPPs或未被修飾的BSA共同孵育后檢測內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白CD31、VE-cadherin、claudin5的表達變化及檢測間充質(zhì)細(xì)

15、胞特異性標(biāo)志性蛋白FSP-1、α-SMA、及vimentin的表達變化。實驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，AOPPs以濃度和時間依賴方式下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白（CD31、VE-cadherin、及claudin5）的mRNA表達水平，但以濃度和時間方式上調(diào)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白(FSP-1、α-SMA、及vimentin)的mRNA表達水平。然而，未經(jīng)修飾的BSA對人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮標(biāo)志性蛋白及間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白的表達水平無明顯影響，

16、提示這些變化與BSA的氧化修飾有關(guān)。以上實驗結(jié)果提示AOPPs可誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞EndMT的發(fā)生。
　　2.AOPPs激活人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)
　　為了探討AOPPs是否會誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，我們使用實時熒光定量PCR法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的標(biāo)志性蛋白GRP78和CHOP的表達。實驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，AOPPs組以濃度和時間依賴方式上調(diào)GRP78和CHOP的mRNA表達水平。但是未經(jīng)修

17、飾的BSA對人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞GRP78和CHOP的表達水平無明顯影響，提示這些變化與BSA的氧化修飾有關(guān)。以上實驗結(jié)果提示AOPPs可誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。
　　綜合上述結(jié)果，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)了AOPPs誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT的過程。
　　結(jié)論：
　　本研究證明了AOPPs可誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT，還證明了AOPPs可激活人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。然而，未修飾的BSA并不能產(chǎn)生A