晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗.pdf

1、本研究的目的在于探討晚期氧化蛋白產(chǎn)物（AOPP）參與肥胖和代謝綜合征發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制。 方法： 一、AOPP的制備。 將20mg/ml小鼠白蛋白與40mmol/1次氯酸等體積混合，室溫放置30分鐘，其摩爾比為1：140（MSA：次氯酸）。制備的AOPP在無內(nèi)毒素PBS中透析24小時，除去游離的次氯酸。用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌后4℃保存。20mg/mlMSA與PBS等體積混合，作為對照。 二、3T

2、3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化。 3T3-L1前脂肪細(xì)胞采用美國ATCC細(xì)胞株，復(fù)蘇后在37度，5%CO2，10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，傳代。細(xì)胞狀態(tài)良好時接種于培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長至融合2d后，加含0.5mmol/L異丁基-3-甲基黃嘌呤、0.25μmol/L地塞米松、10μg/ml胰島素和10%FBS的含糖DMEM（4.5mg/L）培養(yǎng)48h，換以含10μg/ml胰島素10%FBS培養(yǎng)液再培養(yǎng)48h，隨后以含1

3、0%FBS的含糖DMEM（4.5mg/L）培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每隔48h換1次培養(yǎng)液，誘導(dǎo)分化10～12d的3T3-L1細(xì)胞95%以上呈脂肪細(xì)胞表型.實(shí)驗(yàn)前改換用含0.1-0.5%的FBSDMEM中繼續(xù)培養(yǎng)12-24小時，使細(xì)胞處于同步生長狀況，然后用于實(shí)驗(yàn)。 三、細(xì)胞上清中腫瘤壞死因子（TNF-a）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、單核趨化蛋白-1（MCP-1）、脂聯(lián)素（adiponectin）濃度的測定。 3T3-L1前脂肪

4、細(xì)胞分化成熟，用無血清培養(yǎng)基靜置12-24小時，與0、50、100、200μg/ml AOPP或200μg/ml未經(jīng)修飾的MSA共同孵育，于0、3、6、12及24小時收集細(xì)胞上清。在阻斷實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞分別與NADPH氧化酶抑制劑apocynin（100μM）、DPI（10μM），ER應(yīng)激阻斷劑TUDCA（2mM）和PBA（10mM）及NF-κb抑制劑SN50（10μM）預(yù)孵育1小時，用200μg/ml AOPP刺激24小時。收集細(xì)胞上清并

5、進(jìn)行細(xì)胞裂解。 四、AOPP刺激脂肪細(xì)胞后細(xì)胞因子TNF-a、IL-6、MCP-1、adiponectin的mRNA水平表達(dá)檢測。 3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化成熟，與0、50、100、200μg/ml AOPP或200μg/ml未經(jīng)修飾的MSA共同孵育，于0、3、6、12及24小時收集細(xì)胞上清。在阻斷實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞分別與NADPH氧化酶抑制劑apocynin（100μM）、DPI（10μM），ER應(yīng)激阻斷劑TUDCA（2m

6、M）和PBA（10mM）及NF-κb抑制劑SN50（10μM）預(yù)孵育1小時，用200μg/ml AOPP刺激24小時。加入Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。 五、AOPP對NF-κb的激活。 脂肪細(xì)胞分別與50、100、200 AOPP或200μg/ml未經(jīng)修飾的MSA共同孵育0，15min，30min，1h，3h，6h，在阻斷實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞分別與NADPH氧化酶抑制劑apocynin（100μM）、DPI（10μM），E

7、R應(yīng)激阻斷劑TUDCA（2mM）和PBA（10mM）預(yù)孵育1小時，用200μg/ml AOPP刺激6h小時收集細(xì)胞總蛋白Western Blotting檢測NF-κbp65磷酸化及總的p65蛋白含量。 六、葡萄糖攝取率的測定。 將24孔板中誘導(dǎo)分化成熟的脂肪細(xì)胞分別與50、100、200μg/ml AOPP或200μg/ml未經(jīng)修飾的MSA共同孵育0、3、6、12及24小時在阻斷實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞分別與NADPH氧化酶抑制劑a

8、pocynin（100μM）、DPI（10μM），ER應(yīng)激阻斷劑TUDCA（2mM）和PBA（10mM）及NF-κb抑制劑SN50（10μM）預(yù)孵育1小時，之后用200μg/mlAOPP刺激24小時，后以KRP緩沖液洗3次，再以含或不含100nmol/Linsulin的KRP緩沖液37℃孵育30min，加入1mL含0.5mCi/L2-脫氧-[3H]-D-葡萄糖的KRP緩沖液37℃孵育10min。 七、AOPP對胰島素信號通路的影

9、響。 脂肪細(xì)胞分別與50、100、200 AOPP或200μg/ml未經(jīng)修飾的MSA共同孵育0、3、6、12及24小時；在阻斷實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞分別與NADPH氧化酶抑制劑apocynin（100μM）、DPI（10μM），ER應(yīng)激阻斷劑TUDCA（2mM）和PBA（10mM）及NF-κb抑制劑SN50（10μM）預(yù)孵育1小時，用200μg/mlAOPP刺激24小時。最后以含或不含100 nmol/L insulin的KRP緩沖液37

10、℃孵育30min，收集細(xì)胞總蛋白，Western Blotting檢測Akt磷酸化及總的Akt蛋白含量。 八、NADPH依賴的ROS的檢測。 脂肪細(xì)胞分別與50、100、200μg/mlAOPP或200μg/ml未經(jīng)修飾的MSA共同孵育0、5、15、30min、1、3及6h，在阻斷實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞分別與NADPH氧化酶抑制劑apocynin（100μM）、DPI（10μM）、線粒體酶復(fù)合體I抑制劑rotenone（100μM

11、）、線粒體酶復(fù)合體Ⅱ抑制劑TTFA（10μM）、線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅲ氧化中心抑制劑myxothiazol（10μM），黃嘌呤氧化酶抑制劑allopurinol（100μM）、NO合酶抑制劑L-NAME（100μM）及超氧化物歧化酶SOD（200U/ml），環(huán)氧化酶抑制劑吲哚美辛indomethacin（10μM）等預(yù)孵育1小時后用200μg/mlAOPP刺激1h，采用對活性氧敏感的熒光探針DCFH標(biāo)記細(xì)胞，與細(xì)胞共同孵育30分鐘，收

12、集細(xì)胞。 九、AOPP誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞NADPH氧化酶活化。 1.p47phox磷酸化的檢測。 脂肪細(xì)胞與200μg/ml AOPP或200μg/ml未經(jīng)修飾的MSA共同孵育0、5、15、30、及60min收集細(xì)胞總蛋白。免疫沉淀及Western Blotting檢測p47phox磷酸化及總的p47phox蛋白含量。 2.p22phox-p47phox以及p22phox-NOX4結(jié)合的檢測。 脂肪細(xì)胞

13、分別與200μg/mlAOPP或200μg/ml未經(jīng)修飾的MSA共同孵育0、5、15、30及60min，收集細(xì)胞總蛋白。免疫沉淀、Western Blotting檢測p22phox-p47phox的結(jié)合、總的p22phox蛋白含量以及NOX4-p47phox的結(jié)合、總的NOX4蛋白含量。 3.p47phox、p22phox及NOX4蛋白的表達(dá)。 脂肪細(xì)胞與200μg/ml AOPP或200μg/ml未經(jīng)修飾的MSA共同孵

14、育0、6、12及24小時后，提取細(xì)胞總蛋白，Western Blotting檢測p22phox、p47phox和NOX4的表達(dá)。 十、AOPP誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）。 脂肪細(xì)胞與200μg/ml AOPP或200μg/ml未經(jīng)修飾的MSA共同孵育0、30min、1h、3h、6h，12h收集細(xì)胞總蛋白Western Blotting檢測ERstress指標(biāo)PERK、eIF-2α、IRE-1α、JNK磷酸化及總

15、蛋白含量，grp78總蛋白含量的改變。衣霉素tunicamycin（2ug/ml）做為ERS陽性對照。在阻斷實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞分別與NADPH氧化酶抑制劑DPI（100μM）、apocynin（10μM）預(yù)孵育1小時，用200μg/mlAOPP刺激3h，收集細(xì)胞總蛋白。檢測NADPH氧化酶抑制劑對AOPP作用于脂肪細(xì)胞ERstress指標(biāo)改變的影響。 十一、統(tǒng)計(jì)方法。 所有數(shù)據(jù)均代表3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以X±S表示。所有統(tǒng)計(jì)由

16、統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0完成。多個樣本均數(shù)的比較采用One-WayANOVA，兩兩比較采用LSD和SNK，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 一、AOPP以時間和劑量依賴的方式上調(diào)脂肪細(xì)胞促炎因子表達(dá)，下調(diào)脂聯(lián)素表達(dá)。促炎癥因子表達(dá)與NF-κB激活有關(guān)。 二、AOPP以時間和劑量依賴的方式抑制脂肪細(xì)胞糖攝取，使胰島素信號通路受損。 三、AOPP以時間和劑量依賴的方式通過激活NADPH氧化酶依賴的途徑

17、誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生 四、AOPP激活ER應(yīng)激信號通路上蛋白分子，主要表現(xiàn)在磷酸化水平的上調(diào)，及個別分子蛋白表達(dá)量的增加。 五、NADPH氧化酶抑制劑DPI，apocynin及ER應(yīng)激阻斷劑PBA and TUDCA，NF-κB抑制劑SN 50可幾乎阻斷AOPP誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。 六、NADPH氧化酶抑制劑DPI，apocynin及ER應(yīng)激阻斷劑PBA and TUDCA可幾乎阻斷AOPP誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞胰島素抵