2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、缺血再灌注損傷(IschemiaRcperfusionInjury,IRI)是外科手術(shù)過程中常見的、多種因素參與的病理生理過程。IRI可損傷細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),引起一系列的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞水腫,并造成器官功能損傷,甚至引發(fā)死亡。肝臟IRI是一個多分子、多因素參與的病理過程,常見于肝臟移植、嚴(yán)重的肝臟外傷處理、肝臟腫瘤切除等臨床肝臟外科手術(shù)治療過程。鑒于其具體發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,而病理轉(zhuǎn)歸多為肝細(xì)胞凋亡、壞死,嚴(yán)重影響臨床預(yù)后,故其發(fā)病機(jī)制已成

2、為現(xiàn)今的研究熱點。主要相關(guān)的發(fā)病機(jī)制可大致概括為以下五點:1、鈣離子超載;2、氧自由基(ROS)生成過多;3、細(xì)胞因子;4、細(xì)胞凋亡、壞死;5、中性粒細(xì)胞等相關(guān)因素。目前認(rèn)為Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)信號通路在肝臟的發(fā)生發(fā)展、營養(yǎng)代謝、肝細(xì)胞再生和腫瘤發(fā)生中均發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。β-catenin受損將導(dǎo)致肝臟對各種損傷刺激的敏感性增強(qiáng),但其在肝臟缺血/再灌注損傷中的作用機(jī)制尚不明確。
   β-cat

3、enin是一個相對分子量為92000的細(xì)胞內(nèi)糖蛋白,基因在染色體的定位是3p21,正常情況下主要位于細(xì)胞膜,參與由上皮黏蛋白(E-Cad)介導(dǎo)的細(xì)胞黏附,但其在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中有著更為重要的作用。細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin與軸蛋白、糖原合酶激酶3b(GSK3b)、結(jié)腸腺瘤樣息肉(adenomatouspolyposiscoli,APC)蛋白、酪蛋白激酶1(caseinkinase1,CK1)構(gòu)成復(fù)合體,其中軸蛋白和APC蛋白作為支架蛋白

4、,而CK1和GSK3b對β-catenin蛋白進(jìn)行磷酸化,最終使β-catenin在蛋白酶體的作用下被降解。當(dāng)β-catenin失磷酸化時,會從復(fù)合體中脫落,向細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中積聚,與TCF/LEF結(jié)合,啟動與細(xì)胞增殖或抗凋亡相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄,這就是典型的Wnt/β-catenin信號通路;Wnt信號系統(tǒng)具有多效性,研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin軸在肝臟的發(fā)生發(fā)展、營養(yǎng)代謝、肝細(xì)胞再生及腫瘤發(fā)生等方面均發(fā)揮著重要作用;盡管這些研究支持

5、β-catenin的生物學(xué)活性主要由與TCF/LEF相關(guān)的Wnt信號傳導(dǎo)來介導(dǎo),近期有研究認(rèn)為β-catenin還可以發(fā)揮與TCF無關(guān)的轉(zhuǎn)錄輔激活物作用;在正常的生理條件下,β-catenin的生物學(xué)活性主要由與淋巴增強(qiáng)因子/T細(xì)胞因子(lymphoidenhancerfactororT-cellfactor,TCF/LEF)相關(guān)的Wnt信號傳導(dǎo)介導(dǎo),而在不利的病理條件下(缺氧或缺血/再灌注),β-catenin則可能發(fā)揮與TCF無關(guān)的

6、轉(zhuǎn)錄輔激活物作用,幫助肝細(xì)胞適應(yīng)不良環(huán)境,增強(qiáng)生存能力。因此,研究β-catenin蛋白在肝臟缺血/再灌注中的作用及其調(diào)控機(jī)制,對于進(jìn)一步認(rèn)識缺血/再灌注損傷的炎癥反應(yīng)機(jī)制,具有重要的科學(xué)意義。
   本實驗首先構(gòu)建肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin小鼠,經(jīng)剪尾、DNA基因組抽提、PCR、明膠電泳鑒定等檢測,結(jié)果顯示,肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin小鼠構(gòu)建成功。經(jīng)過與Jackson實驗室所提供實驗數(shù)據(jù)對比,我們成功構(gòu)建的肝細(xì)

7、胞特異性敲除β-catenin小鼠。通過將肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin小鼠建立部分肝臟缺血再灌注損傷模型,檢測β-catenin基因敲除組與對照組小鼠肝缺血再灌注損傷時血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、相關(guān)炎性細(xì)胞因子及組織學(xué)改變等,探討β-catenin基因在肝臟缺血再灌注引起肝損傷中所起的作用。
   第一部分,β-cat缺陷小鼠的誘導(dǎo)構(gòu)建
   β-catenin是Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要成員之

8、一,參與體內(nèi)眾多病理生理過程的調(diào)節(jié)。近年來研究表明β-catenin在肝細(xì)胞生長、發(fā)育、分化、應(yīng)激等過程中起到重要的作用。但β-catenin在肝臟缺血再灌注損傷中的作用研究極少,遂選取β-catenin作為本實驗的研究基因,我們應(yīng)用Cre-lox系統(tǒng)構(gòu)建肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin基因小鼠模型。從JointVenturesSipperBK動物實驗室購買的C57BL/6轉(zhuǎn)基因小鼠,4-6周齡,B6.Cg-Tg(MX1-cre)Cg

9、n/J小鼠與β-cateninloxP/LoxP(Ctnnblfl/fl小鼠,Jackson實驗室)雜交,得到Mx-Cre×Ctnnblfl/fl小鼠(此處需剪尾抽提基因組DNA確認(rèn)是否為Mx-Cre×Ctnnb/fl/fl小鼠),分別分3次給Ctnnblfl/fl小鼠和Mx-Cre×Ctnnblfl/fl小鼠腹腔內(nèi)注射poly(I:C),2天注射1次,第6天給予最后一次注射,總和計量約250μg(12.5μg/kg),然后將Mx-Cr

10、e×Ctnnblfl/fl小鼠再次剪尾抽提基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,明膠電泳鑒定,確認(rèn)已成功構(gòu)建β-catenin缺陷小鼠。
   第二部分,β-catenin對小鼠部分肝臟缺血再灌注損傷保護(hù)作用的實驗研究
   目的:通過構(gòu)建特異性敲除小鼠模型觀察β-catenin基因在小鼠缺血再灌注損傷中的作用。方法:應(yīng)用Cre-lox系統(tǒng)構(gòu)建肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin基因小鼠模型,60min半肝血流阻斷制造肝臟缺血再灌注

11、小鼠模型,分別為β-catenin基因敲除組及對照組,再灌注后6h,剖殺小鼠,下腔靜脈取血,離心、取上清,測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST);切取肝左葉,10%福爾馬林固定。余肝組織液氮冰凍后保存于-80℃,隨后送至長征醫(yī)院病理科行肝組織HE染色和免疫組織化學(xué)(IHC)檢測,觀察肝臟組織學(xué)改變;剩余肝組織行實時熒光定量PCR檢測(RT-PCR),觀察炎性因子的表達(dá)情況。結(jié)果:β-catenin基因敲除組的血清學(xué)指標(biāo)(ALT

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