核受體PXR調(diào)控MRP3表達(dá)在結(jié)腸癌耐藥中的作用研究.pdf

1、背景與目的：
　　 結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在我國(guó)有逐年上升趨勢(shì)?；熓墙Y(jié)腸癌的重要治療手段之一。然而,耐藥形成是化療失敗并導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和患者死亡的主要原因之一。多藥耐藥機(jī)制涉及藥物代謝酶和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,但其詳細(xì)作用機(jī)制尚不清楚。
　　 孕烷X受體(pregnane X receptor,PXR)又名類(lèi)固醇和外源性受體(steroid andxenobiotic receptor,SXR),屬核受體家

2、族重要成員之一,在保護(hù)機(jī)體免于內(nèi)源性和外源性物質(zhì)損傷方面有重要作用。PXR可廣泛調(diào)節(jié)藥物代謝及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)。與相應(yīng)配體結(jié)合后被活化,與RXRa以異二聚體形式結(jié)合于靶基因的調(diào)控區(qū)域。PXR調(diào)控的靶基因包括:幾種細(xì)胞色素氧化酶如CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19和CYP286、脫氫酶、羧酸脂酶等;藥物Ⅱ相代謝還原酶如UDP-葡萄糖苷酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyltransferases,UGTs)和谷光苷肽S轉(zhuǎn)移酶(Glut

3、athione S-transferases,GSTs)等;(3)藥物Ⅲ相轉(zhuǎn)運(yùn)體如MDR1、多藥耐藥相關(guān)蛋白家族、有機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)肽2等。這些靶基因都涉及腫瘤多藥耐藥形成。PXR可能通過(guò)對(duì)其靶基因調(diào)控,介導(dǎo)藥物之間相互作用及個(gè)體對(duì)藥物的反應(yīng)差異,改變腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物代謝和轉(zhuǎn)運(yùn),影響腫瘤患者化療敏感性。由上可知,PXR涉及MDR機(jī)制眾多位點(diǎn),這可能更符合體內(nèi)多藥耐藥形成實(shí)質(zhì)及腫瘤患者個(gè)體化治療需要。因此,PXR可能成為腫瘤治療和多藥耐藥研究的潛

4、在靶點(diǎn)。
　　 過(guò)表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體是腫瘤多藥耐藥的主要原因之一。MRP3是多藥耐藥相關(guān)蛋白家族(MRP,ABCC亞家族)的主要成員之一,屬ATP膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在氨基酸序列上與MRP1有58％同源性,編碼分子量為190kD的糖蛋白,表達(dá)于極性細(xì)胞基底側(cè),主要分布于肝、十二指腸、結(jié)腸、腎上腺及胰腺等。MRP3作為一種有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體,能轉(zhuǎn)運(yùn)膽汁酸鹽、葡萄糖醛酸苷結(jié)合物以及某些化療藥物。有研究發(fā)現(xiàn)MRP3與白血病預(yù)后不良有關(guān)。在腫瘤細(xì)胞

5、中MRP3與鉑類(lèi)藥物耐藥相關(guān)。兩個(gè)MRP3多態(tài)性位點(diǎn)已被鑒定可影響非小細(xì)胞肺癌患者鉑類(lèi)藥物敏感性。MRP3基因多態(tài)性與結(jié)腸癌危險(xiǎn)之間的關(guān)系已被研究,提示MRP3與結(jié)腸癌化療的遺傳藥理學(xué)有潛在的關(guān)聯(lián)。這些研究表明MRP3在腫瘤耐藥中的重要作用,也提示MRP3在以鉑類(lèi)藥物為基礎(chǔ)的結(jié)腸癌化療中的可能作用。
　　 MRP3表達(dá)調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。分析MRP3啟動(dòng)子區(qū)5’-端發(fā)現(xiàn)TATA盒較少,含多個(gè)SP1、AP-1、AP-2和LRH-

6、1的結(jié)合位點(diǎn)。大鼠近側(cè)Mrp3啟動(dòng)子區(qū)SP1和LRH-1結(jié)合位點(diǎn)是Mrp3轉(zhuǎn)錄活性所必需的。最近有研究發(fā)現(xiàn)核受體涉及MRP3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,包括PPARa、VDR和RARα。PXR是否涉及其中尚無(wú)定論,但有研究發(fā)現(xiàn)PXR配體可誘導(dǎo)MRP3表達(dá)。
　　 本課題擬通過(guò)檢測(cè)包括PXR在內(nèi)的代謝性核受體及耐藥相關(guān)基因在結(jié)腸癌組織中表達(dá)情況,初步探討PXR和其他代謝性核受體在結(jié)腸癌中意義,并進(jìn)一步分析結(jié)腸癌組織中核受體PXR與耐藥相關(guān)基因的聯(lián)

7、系。通過(guò)活化或敲低PXR表達(dá),研究其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和化療敏感性影響,探討PXR調(diào)控MRP3表達(dá)及可能機(jī)制在結(jié)腸癌耐藥中的作用。
　　 方法
　　 1.收集結(jié)腸癌組織標(biāo)本,采用RT-PCR和Western blot法,檢測(cè)結(jié)腸癌組織中核受體及耐藥相關(guān)基因表達(dá)情況。半定量分析PXR、MRP2和MRP3 mRNA表達(dá),用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)比較癌與正常組織之間的差異,Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)分析PXR與MRP2、MRP3之間的關(guān)系

8、。
　　 2.RT-PCR和Western blot法檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞系核受體PXR表達(dá)情況,及10μM利福平處理LS174T細(xì)胞后PXR表達(dá)變化。MTT法觀察利福平作用后對(duì)LS174T細(xì)胞增殖及對(duì)化療藥物敏感性的影響。
　　 3.選用兩條針對(duì)PXR基因不同靶點(diǎn)的RNAi序列及隨機(jī)對(duì)照序列,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒PXRi1＃、PXRi2＃以及陰性對(duì)照質(zhì)粒PXRi control,轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌LS174T細(xì)胞,用G418穩(wěn)定篩選出相

9、應(yīng)細(xì)胞克隆。RT-PCR和Westernblot法檢測(cè)野生型LS174T細(xì)胞、PXRi control、PXRi1＃和PXRi2＃細(xì)胞PXR和MRP3表達(dá)情況,MTT法檢測(cè)PXR敲低后對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和化療敏感性的影響。
　　 4.RT-PCR和Western blot法檢測(cè)LS174T細(xì)胞經(jīng)10μM利福平或5μM紫杉醇作用后SP1、PXR和MRP3表達(dá)變化。
　　 5.免疫熒光方法檢測(cè)5μM紫杉醇處理LS174T細(xì)胞后

10、膜蛋白MRP3和PXR表達(dá)變化及細(xì)胞定位。
　　 6.用PXR表達(dá)質(zhì)粒、MRP3報(bào)告基因、pRL-SV40質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染LOVO細(xì)胞,分為四組:轉(zhuǎn)染Control組(共轉(zhuǎn)染相應(yīng)空質(zhì)粒)、DMSO組(共轉(zhuǎn)染PXR表達(dá)質(zhì)粒+0.1％DMSO)、RIF組(共轉(zhuǎn)染PXR表達(dá)質(zhì)粒+10μM RIF)和paclitaxel組(共轉(zhuǎn)染PXR表達(dá)質(zhì)粒+5μM paclitaxel),然后用雙熒光素酶報(bào)告基因方法檢測(cè)MRP3報(bào)告基因螢火蟲(chóng)熒光活性,以

11、pRL-SV40質(zhì)粒海腎熒光活性為內(nèi)參照。
　　 結(jié)果
　　 1.在結(jié)腸癌組織中,RARα、PXR、MRP2和MRP3 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)明顯上調(diào),VDR和PPARα mRNA表達(dá)也明顯上調(diào),但FXR、LRH-1、SP1、ABCG2、MDR1和CYP3A4 mRNA表達(dá)變化不明顯。
　　 2.半定量分析顯示
　　 3.在結(jié)腸癌細(xì)胞株LS174T、LOVO、HT29和HCT116中,LS174T細(xì)胞高表

12、達(dá)PXR,低表達(dá)或不表達(dá)LRH-1。
　　 4.在10μM利福平作用下,LS174T細(xì)胞增殖速度明顯加快,第3天、第5天、第7天的490nm波長(zhǎng)處吸光度值(OD)分別為:0.682±0.048、1.183±0.156、1.817±0.095;而0.1％DMSO處理對(duì)照組相應(yīng)的OD值分別為:0.528±0.035、0.920±0.036、1.402±0.092。利福平組OD值均明顯高于相應(yīng)DMSO組,且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0

13、.05)。利福平處理后,可降低細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性。
　　 5.用RNAi技術(shù)特異性沉默LS174T細(xì)胞PXR基因表達(dá),與野生型LS174T細(xì)胞和PXRi control細(xì)胞相比,PXRi1＃和PXRi2＃細(xì)胞中mRNA和蛋白表達(dá)均明顯受到抑制,而相應(yīng)地MRP3表達(dá)也減弱。
　　 6.PXR敲低后,細(xì)胞增殖明顯受到抑制,野生型LS174T細(xì)胞和PXRi control細(xì)胞第3天、第5天、第7天的OD值分別為:0.496±

14、0.029、1.150±0.056、1.57±0.036和0.540±0.016、1.123±0.050、1.54±0.064,兩組值差異均不明顯,且均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);PXRi1＃和PXRi2＃細(xì)胞第3天、第5天、第7天OD值分別為:0.313±0.019、0.640±0.040、0.782±0.073和0.284±0.009、0.680±0.026、0.835±0.059,均明顯低于相應(yīng)PXRi control組,且

15、均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。PXR敲低后,可提高細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。在20μg/ml奧沙利鉑作用下,野生型LS174T細(xì)胞和PXRicontrol細(xì)胞存活率分別為:(36.8±5.4)％,(37.9±6.9)％;PXRi1＃和PXRi2＃細(xì)胞存活率分別下降至:(8.0±1.1)％,(11.4±2.2)％,與PXRi control組相比,且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000;P=0.000)。在5μg/ml5-氟尿嘧啶作用下,野

16、生型LS174T細(xì)胞和PXRicontrol細(xì)胞存活率分別為:(78.9±5.3)％,(80.5±5.6)％;PXRi1＃和PXRi2＃細(xì)胞存活率分別下降至:(57.6±7.0)％,(62.3±6.7)％,與PXRi control組相比,且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008;P=0.029)。
　　 7.激光共聚焦顯微鏡顯示:5μM紫杉醇可增強(qiáng)LS174T細(xì)胞PXR表達(dá),且向核濃聚,細(xì)胞膜MRP3表達(dá)也增強(qiáng)。表明紫杉醇活化PXR

17、后可上調(diào)LS174T細(xì)胞MRP3表達(dá)。
　　 8.DMSO組報(bào)告基因相對(duì)熒光活性是轉(zhuǎn)染Control組的兩倍多,但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(4.67±0.60)×10-2vs(2.23±0.31)×10-2,P=0.095)。共轉(zhuǎn)染處理組分別經(jīng)10μMRif和5μM Paclitaxel處理24h后,其相對(duì)熒光活性均明顯增強(qiáng):利福平組為(7.93±0.91)×10-2,與DMSO組相比,升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025);紫杉醇組

18、為(12.30±1.85)×10-2,與DMSO組相比,升高更明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　 結(jié)論
　　 1.核受體PXR、MRP2和MRP3在結(jié)腸癌組織中差異上調(diào),提示其與結(jié)腸癌耐藥相關(guān);
　　 2.結(jié)腸癌及相應(yīng)正常組織中,MRP3與核受體PXR mRNA表達(dá)呈正相關(guān);
　　 3.核受體PXR配體利福平活化PXR,可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖,降低結(jié)腸癌細(xì)胞化療敏感性;
　　 4.R