HOXB9調(diào)控CXCL1在結(jié)腸癌中的功能研究.pdf

1、背景和目的：
　　結(jié)腸癌是人類常見的消化道惡性腫瘤,全球每年新發(fā)病例已增至近60萬(wàn)，隨著人類工業(yè)化、城市化、老齡化的進(jìn)展，其發(fā)病率正以每年2.0-4.2％的速度遞增[1]，其發(fā)病率居惡性腫瘤第三位,死亡率居第四位。目前,隨著外科手術(shù)技術(shù)的進(jìn)步、新輔助化療方案及靶向化療藥物的運(yùn)用,結(jié)腸癌患者近期療效有所改善,但患者總生存期并無(wú)明顯改善,5年總生存率約為50%-60%[2]，其中轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是主要因素。結(jié)腸癌研究的重心在于其發(fā)生、發(fā)展及

2、轉(zhuǎn)移機(jī)制。
　　結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)涉及多基因、多因素、多階段，極為復(fù)雜的生物學(xué)行為。癌基因和抑癌基因的先后發(fā)現(xiàn),信號(hào)傳導(dǎo)通路的逐漸闡明,大大地加深了人們對(duì)結(jié)腸癌癌變機(jī)制的了解。HOXB9是HOX基因家族的一員，近年來(lái)許多研究證實(shí) HOXB9在腫瘤中表達(dá)異常，并參與誘導(dǎo)腫瘤血管的生成[3]、細(xì)胞EMT及通過誘導(dǎo)相應(yīng)分子信號(hào)[4]、影響腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的過程[5]，但目前其機(jī)制仍不清楚。
　　CXCL1即趨化因子生長(zhǎng)調(diào)節(jié)基因

3、1,屬于趨化因子CXC家族。CXCL1在巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞中表達(dá),并呈現(xiàn)中性粒細(xì)胞趨化活性[6]。CXCL1的趨化因子受體 CXCR2需與其結(jié)合后才表現(xiàn)出趨化作用[7]?，F(xiàn)有研究表明,CXCL1參與了多種腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等,但CXCLI在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的研究結(jié)論尚不明確。研究 CXCLI在結(jié)腸癌中的表達(dá)和作用,將有助于我們進(jìn)一步深刻認(rèn)識(shí)結(jié)腸癌的生物學(xué)特征,并期望具有臨床意義。
　　本課題組在前期研究表明HOXB9蛋白在結(jié)腸癌組織

4、中呈過表達(dá)，HOXB9基因與結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲及遷移密切相關(guān)的基礎(chǔ)上，探索研究HOXB9可能具有的結(jié)腸癌基因表達(dá)、調(diào)控作用。本課題將從多個(gè)層面,釆用生細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等多學(xué)科、多手段闡明HOXB9通過調(diào)控CXCL1基因影響結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為，并結(jié)合臨床研究驗(yàn)證HOXB9調(diào)控CXCL1基因在結(jié)腸癌中發(fā)揮重要作用，為更好的認(rèn)識(shí)結(jié)腸癌提供新的理論，為臨床診療策略的選擇及抗癌措施的實(shí)施發(fā)提供新的理論依據(jù)。
　　方法：

5、　　第一部分：Hoxb9和cxcl1基因相關(guān)性
　　(1)為了研究Hoxb9基因在結(jié)腸癌細(xì)胞中的影響以及與相關(guān)基因的關(guān)聯(lián)，采用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)分析初步篩查Hoxb9和CXCL1相關(guān)性。
　　(2)釆用Western-blot和real-time PCR分別證實(shí)芯片結(jié)果的真實(shí)性。
　　第二部分：HOXB9調(diào)控CXCL1在結(jié)腸癌細(xì)胞的分子生物學(xué)機(jī)制研究
　　(1)為了探求HOXB9與CXCL1在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移

6、能力的關(guān)系,把結(jié)腸癌細(xì)胞 SW620和LOVO作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,采用RNA干擾，通過 Westen-blot和real-time PCR驗(yàn)證HOXB9調(diào)控CXCL1的客觀現(xiàn)象。
　　(2)構(gòu)建有效的質(zhì)粒，對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行有效的分組及分別予以干擾和上調(diào)，采用劃痕及Transwell侵襲遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)HOXB9通過調(diào)控CXCL1的表達(dá)影響結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。
　　(3)構(gòu)建相應(yīng)質(zhì)粒，采用回復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)HOXB9調(diào)控CXCL

7、1影響結(jié)腸癌細(xì)胞增殖與遷移能力。
　　第三部分：HOXB9調(diào)控CXCL1影響結(jié)腸癌腫瘤生物學(xué)行為
　　(1)建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSIREN-HOXB9質(zhì)粒和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的SW620細(xì)胞株予以分組接種裸鼠，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析荷瘤裸鼠的腫瘤生物學(xué)行為。
　　(2)運(yùn)用HE染色、免疫組化和MVD檢測(cè)方法證實(shí)HOXB9調(diào)控CXCL1影響結(jié)腸癌腫瘤生物學(xué)行。
　　第四部分：人結(jié)腸癌組織中Hoxb9和cxcl1蛋白的表達(dá)及其臨床意義<

8、br>　　(1)人結(jié)腸癌組織中Hoxb9和CXCL1蛋白的表達(dá)及其臨床意義，HOXB9和CXCL1的表達(dá)均與腫瘤臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)程度、腫瘤病理分期和手術(shù)根治度存在關(guān)聯(lián)（P<0.01）
　　(2)患者HOXB9和CXCL1的不同表達(dá)特征對(duì)生存時(shí)間的影響，影響生存時(shí)間的多因素行Cox回歸分析。
　　結(jié)果：
　　第一部分：
　　(1)基因表達(dá)譜芯片技術(shù)分析初步篩查得出結(jié)果 Hoxb9和CXCL1具有相

9、關(guān)性
　　(2)real-time PCR和Western-blot分別證實(shí)基因芯片結(jié)果分析的可靠性
　　第二部分：
　　(1)以結(jié)腸癌細(xì)胞系(SW620和LOVO)為研究對(duì)象,通過轉(zhuǎn)染、干擾等方法，采用Westen-blot、real-time PCR同時(shí)在蛋白水平及mRNA水平明確HOXB9調(diào)控CXCL1。
　　(2)構(gòu)建有效質(zhì)粒，結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行有效的分組，分別予以干擾和上調(diào)方法證實(shí)HOXB9通過調(diào)控CXCL

10、1的表達(dá)影響結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，并予以證實(shí)。
　　(3)采用回復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)HOXB9調(diào)控CXCL1影響結(jié)腸癌細(xì)胞增殖與遷移能。
　　第三部分：
　　(1)體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí) HOXB9調(diào)控 CXCL1影響裸鼠結(jié)腸癌腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
　　(2) HE染色、免疫組化和MVD檢測(cè)方法證實(shí)HOXB9調(diào)控CXCL1影響結(jié)腸癌腫瘤生物學(xué)行。
　　第四部分：
　　(1)人結(jié)腸癌組織中Hoxb9和CXCL1蛋白

11、的表達(dá)及其臨床意義，HOXB9和CXCL1的表達(dá)均與腫瘤臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)程度、腫瘤病理分期和手術(shù)根治度存在關(guān)聯(lián)（P<0.01）
　　(2)患者HOXB9和CXCL1的不同表達(dá)特征對(duì)生存時(shí)間的影響
　　結(jié)論：
　　1、HOXB9與CXCL1基因在結(jié)腸癌中存在關(guān)聯(lián)性，并證實(shí)HOXB9能夠影響并調(diào)控CXCL1。
　　2、HOXB9通過調(diào)控CXCL1影響結(jié)腸癌腫瘤生物學(xué)行為，可能是解釋結(jié)腸癌生物學(xué)行為的