CYP1A1基因在豬支原體肺炎發(fā)病過程中的功能研究.pdf

1、豬支原體肺炎是由豬肺炎支原體引起的一種慢性接觸性呼吸道傳染病。細(xì)胞色素P450是一種含高鐵血紅素的蛋白酶，主要參與催化機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)的氧化反應(yīng)，參與機(jī)體內(nèi)藥物的氧化代謝和類固醇類物質(zhì)的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化。豬CYP1A1屬于豬P450家族，是機(jī)體代謝活化多烷芳烴、芳香胺類前致癌物質(zhì)主要功能酶，最新研究表明細(xì)胞色素P450在炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮作用。
　　目的:通過構(gòu)建不同表達(dá)水平的CYP1A1基因的豬肺泡巨噬細(xì)胞模型，構(gòu)建豬支原體

2、肺炎體外感染模型，探究CYP1A1基因在豬肺炎支原體感染炎癥反應(yīng)過程中的功能。
　　方法:RT-PCR擴(kuò)增豬CYP1A1基因，目的片段純化后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后菌液擴(kuò)增，得到pMD18-T-CYP1A1重組質(zhì)粒并測序鑒定，用NotI和XhoI分別對重組質(zhì)粒及pcDNA3.1(+)/zeo進(jìn)行雙酶切，T4 DNA連接酶連接酶切并純化后的線性DNA片段，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，菌液擴(kuò)增，獲得真核表達(dá)載體pcDNA3.1(

3、+)/zeo-CYP1A1質(zhì)粒，將該質(zhì)粒用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染至豬肺泡巨噬細(xì)胞系3D4/21，zeocin抗性篩選獲得CYP1A1過表達(dá)細(xì)胞系，RT-PCR、Western-blot鑒定基因表達(dá);用CYP1A1基因siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞干擾CYP1A1表達(dá)，獲得Si組細(xì)胞。用豬肺炎支原體感染過表達(dá)細(xì)胞，對照組和陰性對照組細(xì)胞、Si組細(xì)胞，檢測炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及PPAR-γ受體基因的mRNA表達(dá)水平。<

4、br>　　結(jié)果:
　　1、成功克隆獲取豬CYP1A1基因序列，NCBI比對結(jié)果吻合率達(dá)99％，且成功構(gòu)建真核表達(dá)載體，酶切鑒定正確。
　　2、Zeocin濃度為100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml、300μg/ml五個梯度篩選細(xì)胞，300μg/ml一周內(nèi)全部死亡，250μg/ml組細(xì)胞在第14天全部死亡，其他細(xì)胞存活至第三周。
　　3、以6孔板進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，Zeocin篩選，28日后觀

5、察到穩(wěn)定的抗性克隆，其中，質(zhì)粒體2000的量為3.75ul/孔，重組質(zhì)粒為2.5ug/孔的轉(zhuǎn)染效果最佳。
　　4、篩選得到的細(xì)胞，RT-PCR檢測到CYP1A1的表達(dá)，Western-blot檢測到CYP1A1的高表達(dá)。
　　5、siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞干擾CYP1A1基因的表達(dá)，定量PCR對siRNA轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了評估，干擾效果顯著。
　　6、感染炎癥后，各處理組炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的表達(dá)

6、量出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，其中CYP1A1過表達(dá)組細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的表達(dá)量出現(xiàn)極顯著上調(diào)(P＜0.01)的時間為4h、24h、12h、4h;正常組和空載組細(xì)胞TNF-α、IL-1β和、IL-6、IL-8出現(xiàn)極顯著上調(diào)的時間分別為4h、12h、12h、4h; Si組細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8出現(xiàn)極顯著上調(diào)的時間分別為4h、4h、12h、4h。感染后相同時間點炎性因子表達(dá)量比較，過表組細(xì)胞在感染

7、后的大部分時間段炎性因子表達(dá)量均顯著低于空載組和正常組(P＜0.05)，其中TNF-α表達(dá)量在4h極顯著低于空載組和正常組(P＜0.01); IL-1β表達(dá)量在12h極顯著低于空載組和正常組(P＜0.01); IL-6表達(dá)量在4h、12h極顯著低于空載組和正常組(P＜0.01); IL-8在12h極顯著低于其他各處理組(P＜0.01)。Si組細(xì)胞在感染后的大部分時間段炎性因子表達(dá)量均顯著高于空載組和正常組(P＜0.05)，其中，TNF-

8、α的表達(dá)量在12h極顯著高于空載組和正常組(P＜0.01);IL-1β表達(dá)量在4h和24h極顯著高于正常組和空載組(P＜0.01); IL-8的表達(dá)量在24h極顯著高于空載組和正常組(P＜0.01)。
　　7、各處理組細(xì)胞PPAR-γ均12h出現(xiàn)極顯著上調(diào)(P＜0.01)，過表達(dá)組細(xì)胞在感染前后大部分時間點PPAR-細(xì)表達(dá)量顯著高于空載組和正常組(P＜0.05)，Si組細(xì)胞在感染前后大部分時間點PPAR-γ表達(dá)量顯著低于空載組和正