MEN1基因在鼠胚胎早期發(fā)育中的作用機制及其對SOX4基因調(diào)控的研究.pdf

1、研究目的和背景：Men1基因是多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤1型（MEN1）的致病基因，其在多種胚胎組織和成人組織中表達。人類Men1基因定位于11q13,編碼一個含610個氨基酸殘基的蛋白，Menin。多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病1型(MEN1)是一種常染色體顯性疾病，以家族性的甲狀旁腺瘤、胰島瘤和垂體前葉腫瘤為特征。而在胚胎發(fā)育中Men1基因純合突變的小鼠也會引起多種器官缺陷，包括神經(jīng)系統(tǒng)，心臟，肝臟，顱，腦等，并導致胚胎死亡。所以其在胚胎發(fā)育中起重要的作

2、用。但其分子機制目前仍不甚清楚。 胚胎干細胞（ESCs）是高度未分化的具有多能性的細胞，在懸浮培養(yǎng)時能自動相互聚集成一細胞團，這一細胞團稱為胚胎體（Ebs）。懸浮培養(yǎng)3-8天，胚胎體（Ebs）形成包含有內(nèi)胚層、中胚層和外胚層的結(jié)構(gòu)，形態(tài)上與6天到8天的卵囊期(egg-cylinder stage)的胚胎相似。培養(yǎng)8-10天時胚胎體（Ebs）形成一個大的囊狀結(jié)構(gòu)，類似早期胚胎種植到子宮內(nèi)壁后的內(nèi)臟卵黃囊(visceral yol

3、k sac)結(jié)構(gòu)。也就是說，以胚胎體（Ebs）方式在體外模擬體內(nèi)的早期胚胎發(fā)育，能夠用來研究胚胎早期發(fā)育的機制。 在前期的芯片研究中,我們發(fā)現(xiàn)Sox4基因在野生型（Men1+/+）ES細胞及Men1基因敲除(Men1-/-)的ES細胞所形成的EB中存在表達差異。Sox4(Sry/hydroxymethylglutaryl box transcription factor 4)基因是一個癌基因，而且在早期胚胎發(fā)育過程也發(fā)揮重要作

4、用，其基因敲除后的表型與Men1基因敲除所引起的發(fā)育異常有部分的相同。故我們推測Sox4基因是受Menin調(diào)控的基因之一。我們想通過報告基因的方法進一步明確Men1基因?qū)ox4基因的調(diào)控作用，為進一步的研究打下基礎(chǔ)。 材料與方法： 1)以野生型(Men1+/+)和Men1基因敲除(Men1-/-)的ES細胞為研究對象，觀察這兩種細胞在體外分化時所形成的胚胎體（Ebs）的數(shù)目，形狀，大小等形態(tài)學上的不同。并提取兩種細

5、胞所形成的胚胎體（Ebs）的RNA，采用Affymatrix基因表達譜芯片，分析野生型EB和Men1-/-的EB的基因表達差異并用實時定量PCR技術(shù)對基因芯片結(jié)果進行驗證。 2)構(gòu)建包含小鼠Sox4基因啟動子的報告基因載體，利用熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析Menin對Sox4基因啟動子活性的影響；同時利用實時定量PCR技術(shù)檢測Sox4基因在Men1-/-的小鼠胚胎成纖維(Mef)細胞和野生型小鼠胚胎成纖維(Mef)細胞中的表達差異

6、。 結(jié)果： 1)觀察兩種ES細胞所形成的懸浮培養(yǎng)的EB共10天，兩者在數(shù)目、大小上無明顯差別。MEN1-/-ES細胞形成的EB中間深色區(qū)域出現(xiàn)缺失和偏向的數(shù)量較正常ES細胞明顯增多。 而基因芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)多個與不同器官發(fā)育相關(guān)的基因表達變化，如骨發(fā)育：Postn，Runx2，Msx2；肝臟發(fā)育：Kdr；造血系統(tǒng)：Hox9，Kitl；胰腺發(fā)育：Sox4，F(xiàn)oxa1，Btc，Igf2，Nfatc1等。

7、2)Sox4基因啟動子活性在Men1-/-的Mef細胞中明顯高于在野生型的Mef細胞中的活性，而在Men1-/-的Mef中轉(zhuǎn)入Men1基因后，Sox4基因啟動子活性降低。同時Sox4基因在Men1-/-Mef細胞的mRNA的表達是在野生型Mef細胞中的2.5倍。 結(jié)論： 1）骨發(fā)育：Postn，Runx2，Msx2；肝臟發(fā)育：Kdr；造血系統(tǒng)：Hox9，Kitl；胰腺發(fā)育：Sox4，F(xiàn)oxa1，Btc，Igf2，Nf