抗玉米赤霉烯酮和抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇抗體的制備及性質(zhì)分析.pdf

1、玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)主要是由禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)和黃色鐮刀菌(Fusariumculmorum)等鐮刀菌產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物。ZEN和DON主要污染玉米、大麥、小麥等谷物及其制品,它們不僅可以導(dǎo)致人和動(dòng)物產(chǎn)生生殖毒性、免疫毒性、細(xì)胞毒性,而且還與癌癥有關(guān)。目前ZEN和DON等真菌毒素的檢測(cè)方法主要是儀器分析方法和免疫

2、學(xué)分析方法,而儀器分析方法存在成本高、耗時(shí)長(zhǎng)、樣品處理和凈化困難等缺點(diǎn),使得免疫學(xué)分析方法越來越受到分析檢測(cè)部門,特別是基層檢測(cè)部門的青睞。其中ELISA法以其快速、靈敏、低成本的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于各種真菌毒素的檢測(cè),而制備出效價(jià)好、靈敏度高和特異性強(qiáng)的抗體是建立ELISA方法中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　 本研究分別采用活性酯法和Mannich法構(gòu)建了ZEN的完全抗原,并采用紫外光譜法對(duì)其進(jìn)行了分析和鑒定。同時(shí)采用活性酯法和N,N’-羰基

3、二咪唑(N,N'-Carbonyldiimidazole,CDI)法分別構(gòu)建了DON的免疫抗原和包被抗原,并采用2,4,6-三硝基苯磺酸(Triniro-benzene-sulfonic-acid,TNBS)法對(duì)DON完全抗原進(jìn)行了分析和鑒定。以構(gòu)建的完全抗原免疫BALB/c小鼠制備抗血清,采用ELISA方法對(duì)抗血清的效價(jià)、靈敏度和特異性進(jìn)行了分析,具體研究?jī)?nèi)容如下。
　　 1.ZEN完全抗原的制備
　　 ZEN分子量為

4、318.4,是只有反應(yīng)原性而無免疫原性的半抗原,只有與載體蛋白偶聯(lián)后,才能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。本研究分別采用活性酯法和Mannich法構(gòu)建了ZEN的完全抗原。采用活性酯法時(shí),首先將ZEN衍生為ZEN肟(ZEN-oxime,ZENO),然后將ZENO與cBSA(cOVA)偶聯(lián)制備了完全抗原ZENO-cBSA(cOVA)；采用Mannich法時(shí),直接利用甲醛將ZEN與BSA(OVA)偶聯(lián)制備了完全抗原ZEN-BSA(OVA)。根據(jù)紫外光譜結(jié)果

5、,可初步推測(cè)ZENO與cBSA(cOVA),ZEN與BSA(OVA)偶聯(lián)成功,偶聯(lián)比分別為nZENO:ncBSA=9.2:1、nZENO:ncOVA=10.3:1、nZEN:nBSA=15.9:1和nZEN:nOVA=6.8:1。
　　 2.DON完全抗原的制備
　　 DON分子量為296.3,根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn),本研究分別采用活性酯法和CDI法構(gòu)建了DON的免疫抗原和包被抗原。采用活性酯法時(shí),首先將DON衍生為3-半琥珀酰

6、-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-HS-DON),然后將3-HS-DON與BSA偶聯(lián)制備了免疫抗原3-HS-DON-BSA；采用CDI法時(shí),直接利用CDI對(duì)DON的活化作用與OVA進(jìn)行偶聯(lián)制備了包被抗原DON-OVA。通過TNBS法對(duì)偶聯(lián)前后載體蛋白的游離氨基數(shù)目的測(cè)定,結(jié)果表明DON與載體蛋白偶聯(lián)后,載體蛋白游離氨基數(shù)目減少,初步推測(cè)完全抗原構(gòu)建成功,偶聯(lián)比分別為n3-HS-DON:ncBSA=9.5:1和nDON:nOVA=7.2:1。

7、r>　　 3.抗ZEN和DON抗血清制備
　　 將ZEN-BSA、ZENO-cBSA和3-HS-DON-cBSA(100μg/只)以多點(diǎn)多次的方法分別免疫BALB/c小鼠,每種抗原免疫3只并按順序編號(hào)(1～9)。分析抗體產(chǎn)生進(jìn)程,結(jié)果表明,從2免開始就有明顯抗體產(chǎn)生,4免后3號(hào)小鼠效價(jià)最高可達(dá)1:12800,而1和2號(hào)效價(jià)為1:6400；4和5號(hào)小鼠效價(jià)最高可達(dá)1:12800,6號(hào)小鼠效價(jià)為1:6400；7和8號(hào)小鼠效價(jià)為1:

8、3200,9號(hào)小鼠效價(jià)為1:6400。取每組中效價(jià)高的3、5和9號(hào)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 4.ELISA條件的優(yōu)化
　　 分別以相應(yīng)的包被抗原和抗體為材料,通過方陣滴定實(shí)驗(yàn)獲得間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的最佳包被抗原和抗體工作濃度為ZEN-BSA免疫的3號(hào)小鼠抗血清以PBST稀釋至1:12800,ZEN-OVA的包被濃度為1μg/mL；ZENO-cBSA免疫的5號(hào)小鼠抗血清以PBST稀釋至1:12800,ZENO-cOVA的包被濃

9、度為1μg/mL；3-HS-DON-cBSA免疫的9號(hào)小鼠抗血清以PBST稀釋至1:12800,DON-OVA的包被濃度為4μg/mL。
　　 5.抗ZEN和DON抗血清的靈敏度及特異性分析
　　 根據(jù)上述條件,采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA分別對(duì)3、5和9號(hào)小鼠的抗血清進(jìn)行分析,以競(jìng)爭(zhēng)抗原的濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),競(jìng)爭(zhēng)抑制率為縱坐標(biāo),作競(jìng)爭(zhēng)抑制率曲線。結(jié)果表明:3號(hào)小鼠線性方程為y=-12.92x+100.35(R2=0.9878)

10、,ZEN的半數(shù)抑制濃度(IC50)為7.6μg/mL,檢測(cè)限為0.075μg/mL,線性檢測(cè)范圍為0.01～10μg/mL；5號(hào)小鼠線性方程為y=-13.61x+100.95(R2=0.9919),ZEN的IC50為5.8μg/mL,檢測(cè)限為0.093μg/mL,線性檢測(cè)范圍為0.01～10μg/mL;9號(hào)小鼠線性方程為y=-12.35x+101.05(R2=0.9906),DON的IC50為14.2μg/mL,檢測(cè)限為0.103μg/