脫氧雪腐鐮刀菌烯醇誘導(dǎo)倉鼠腎細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的研究.pdf

1、目的：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），又名嘔吐毒素（vomitoxin），是由鐮刀菌屬病原真菌產(chǎn)生的真菌毒素之一。DON廣泛污染谷類及其制品，嚴重威脅人和動物的健康。研究報道DON具有很強的細胞毒性，對于原核細胞、真核細胞等均具有明顯的毒性作用，DON可抑制DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，抑制線粒體功能并誘導(dǎo)細胞凋亡。其中誘導(dǎo)細胞凋亡是DON發(fā)揮致病作用，產(chǎn)生免疫毒性的重要途徑之一，也是近年來霉菌毒素研究領(lǐng)域中

2、的熱點問題。目前關(guān)于DON對細胞毒性研究的報道較多，但關(guān)于DON誘導(dǎo)細胞凋亡具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制還很少有報道。鑒于上述情況，本實驗選用DON敏感細胞株倉鼠腎細胞BHK-21為研究對象，經(jīng)DON處理后，觀察其對BHK-21細胞的形態(tài)學(xué)、線粒體膜電位及凋亡通路相關(guān)蛋白表達變化的影響，以其探討DON誘導(dǎo)細胞凋亡的作用機制，為深入研究DON的毒性機理、全面了解DON的生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)。
　　 試驗一：
　　 本試驗將處于對數(shù)生長

3、期的BHK-21細胞以不同濃度的DON（DON終濃度分別為125、250、500、1000、2000ngmL-1）進行處理，另設(shè)空白培養(yǎng)基對照組。24h后，倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)學(xué)改變，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。結(jié)果顯示：不同濃度的DON對BHK-21均有誘導(dǎo)凋亡的作用，各濃度組的凋亡率都顯著高于對照組（P<0.05）；細胞DNA發(fā)生斷裂，形成DNAladder。
　　 試驗二：
　　 本試驗將處于對數(shù)生長期的

4、BHK-21細胞以不同濃度的DON（DON終濃度分別為125、250、500、1000、2000ngmL-1）進行處理不同時間（6h、12h、24h）后，JC-1染色，流式細胞儀檢測線粒體膜電位的變化情況。結(jié)果顯示：在DON作用時間（24h）相同的情況下，除125 ng mL-1外，其他各濃度組與對照組相比均差異顯著（P<0.05），隨著DON濃度的增大，線粒體膜電位下降的程度越明顯；在DON濃度（2000 ngmL-1）相同的情況下，

5、各試驗組與對照組相比均差異顯著（P<0.05），隨著DON作用時間的延長，細胞線粒體膜電位呈逐漸下降的趨勢。采用細胞免疫化學(xué)染色檢測不同濃度的DON處理對BHK-21細胞中Bax、Bcl-2、p53表達的變化，結(jié)果顯示，DON處理細胞24 h，Bax，p53蛋白表達顯著高于對照組，Bcl-2蛋白表達均低于對照組。
　　 試驗三：
　　 采用蛋白免疫印跡（Western Blotting）檢測不同濃度的DON處理對BHK-

6、21細胞中caspase-3、caspase-9、AIF、caspase-12蛋白表達的變化。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示：caspase-3、caspase-9，AIF、caspase-12蛋白分子量分別為35 KD、47 KD、57 KD、55 KD經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，細胞對照組、DON處理組均在相應(yīng)位置出現(xiàn)了棕色的陽性條帶，且隨DON濃度的增加陽性條帶顏色逐漸加深，寬度逐漸增加。以actin（42KD）作為內(nèi)參照，采用圖像分析