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文檔簡介
1、目的:骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis)是嚴重影響人類生活的疾病之一,由于關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)缺乏血液供應(yīng),一旦損傷,自我修復(fù)能力極差,而且病情會隨著時間逐步進展。隨著我國乃至全球老年人口的增加,骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率處于上升趨勢,同時骨關(guān)節(jié)疾病開始趨于年輕化,而且人數(shù)還在不斷增加。目前關(guān)節(jié)軟骨缺損的治療方法雖然給軟骨缺損修復(fù)帶來了新希望,但是仍存在不足之處,主要包括需要從供區(qū)取出骨、軟骨組織或在正常組織上鉆孔,給供區(qū)造成新的損傷,而且需要至少2次
2、以上的手術(shù),同時由于供體來源有限,不能完全滿足臨床需求,因此,尋求一種替代骨軟骨移植物是急需解決的問題。本工作在文獻報道和前期研究的基礎(chǔ)上,以殼聚糖和蠶絲蛋白為原材料通過冷凍干燥法來制作支架,然后將TGF-β1質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的BMSCs作為種子細胞種植在支架上構(gòu)建組織工程化培養(yǎng)模型,并自行分泌生長因子,通過自分泌和旁分泌作用,在微環(huán)境下誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細胞分化。研究結(jié)果對修復(fù)骨軟骨缺損有重大的意義,也為治療骨關(guān)節(jié)炎提供一定的臨床參考
3、。因此,研究工作對于相關(guān)骨軟骨疾病的治療與康復(fù)進行了有意義的探索。
方法:
1采用密度梯度離心法分離大鼠BMSCs,并對所獲得的細胞進行體外培養(yǎng)及鑒定。研究骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)方法,了解其一般生物學(xué)特性,為進一步研究打下基礎(chǔ)。
2蠶絲蛋白-殼聚糖組織工程支架的制備:蠶絲蛋白與殼聚糖按不同比例制備三種蠶絲蛋白-殼聚糖支架,對制備的支架進行傅里葉紅外光譜結(jié)構(gòu)分析;考察復(fù)合支架的密度、孔隙率、熱水溶失率、力
4、學(xué)性能、吸水膨脹率、抑菌能力等理化性質(zhì);支架接種細胞后用MTS法考察細胞在支架上培養(yǎng)1、3、5、7d的增殖情況;SEM掃描電鏡觀察各組支架的孔徑大小、形態(tài)及細胞在最優(yōu)支架上培養(yǎng)2、5d的黏附情況;HE染色觀察細胞在最優(yōu)支架上培養(yǎng)5、10d的形態(tài)及滲透生長情況。
3基因轉(zhuǎn)染及鑒定:取TGF-β1質(zhì)粒及其空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞涂板,并挑單克隆,用LB培養(yǎng)基擴增,小量提取質(zhì)粒、測序。通過脂質(zhì)體法將獲得的TGF-β1質(zhì)粒及其空載體質(zhì)
5、粒轉(zhuǎn)染第三代BMSCs:具體操作步驟按照脂質(zhì)體lipofection2000說明書進行。轉(zhuǎn)染48h后行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測TGF-β1mRNA表達水平。
4組織工程化培養(yǎng)模型的建立:用0.25%胰酶消化轉(zhuǎn)染TGF-β1質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒48h后的第三代BMSCs及空白對照組的第三代BMSCs,含10%胎牛血清的
6、LG-DMEM培養(yǎng)基終止消化,重懸細胞,計數(shù),以2×106/mL接種到支架上,每塊支架接種約20μL細胞懸液,構(gòu)建組織工程化培養(yǎng)模型。實驗共分三組:A組(TGF-β1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組)、B組(空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組)和C組(空白對照組)。
5組織工程化培養(yǎng)模型體外培養(yǎng)3、6、9、12d后分別行酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immnosorbent assay,ELISA)法檢測培養(yǎng)液上清中TGF-β1蛋白的含量。
7、 6組織工程化培養(yǎng)模型體外培養(yǎng)3、6、9、12d后分別利用阿利新藍法測定培養(yǎng)液上清中酸性糖胺多糖的含量。
7組織工程化培養(yǎng)模型體外培養(yǎng)2周后行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測支架細胞復(fù)合體中Ⅱ型膠原、Sox9 mRNA的表達水平。
結(jié)果:
1采用密度梯度離心法可以成功分離大鼠BMSCs,可見原代細胞剛接種
8、時散在分布,呈圓形,24h后有部分細胞貼壁。貼壁細胞呈長梭形或多角形,第3-7d,細胞融合生長,呈梭形且呈集落樣增殖,7-10d可以達到80-90%融合,傳代后細胞生長明顯加速,生長活躍,并呈典型的漩渦樣生長。隨著傳代次數(shù)的增加,可得到高純度的BMSCs。經(jīng)3次傳代后,細胞形態(tài)較為一致。
2取生長狀態(tài)良好的第三代BMSCs,經(jīng)過成軟骨、成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后,分別采用天狼猩紅染色、甲苯胺藍染色、ALP染色及茜素紅染色來鑒定誘導(dǎo)后軟骨
9、細胞、成骨細胞表型。結(jié)果證實本實驗采用密度梯度離心法提取的BMSCs具有多向分化潛能。
3傅里葉紅外光譜證明:殼聚糖由糖特征結(jié)構(gòu)β-1,4糖苷鍵相互連接而成,故各組在1154 cm-1及897 cm-1處出現(xiàn)了特征性吸收峰,對于CS-SF支架材料來說,隨著CS含量的增高,代表無規(guī)卷曲/α螺旋結(jié)構(gòu)的吸收峰1654 cm-1和1540cm-1不斷減小,而對應(yīng)于1628 cm-1和1516 cm-1處相當于β-折疊結(jié)構(gòu)的吸收峰不斷增
10、大,表明CS的加入改性了SF的結(jié)構(gòu),使α螺旋結(jié)構(gòu)/無規(guī)卷曲向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變;各組密度分別為0.18±0.03,0.20±0.01,0.18±0.04(g/ml);孔隙率分別為87.36±2.15,77.82±1.37,72.22±1.37(%);熱水溶失率分別為:0,0,3.12±1.26(%);彈性模量分別為:8.35±2.64,15.50±1.64,12.55±3.37(KPa);吸水膨脹率分別為:1528.52±194.63,1
11、078.22±100.52,1320.05±179.97(%);抑菌圈直徑分別為:18±1,22±2,20.33±1.53(mm); SEM下觀察1組支架孔徑在50-250μm之間,孔徑大小較為一致,孔相通性好,其它兩組結(jié)構(gòu)紊亂,孔徑大小不一,孔相通性差;生長曲線結(jié)果示:1d時1組中活細胞數(shù)明顯高于2組(P<0.01),3d、5d和7d時,1組中活細胞數(shù)量明顯高于2組和3組(P<0.01); SEM可見細胞呈梭形黏附于支架上,隨著培養(yǎng)天
12、數(shù)的增加周圍出現(xiàn)較多量細胞外基質(zhì);HE染色發(fā)現(xiàn)BMSCs在培養(yǎng)初期沿著支架材料內(nèi)部空隙貼壁生長,隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,貼壁細胞呈集落樣生長,可明顯看到細胞間連接;結(jié)果證實:CS-SF支架的細胞相容性良好,能促進BMSCs的存活和黏附,可以為細胞提供一個開放的生長環(huán)境,促進細胞向支架內(nèi)部生長,并保證足夠的營養(yǎng)和氣體交換。
4脂質(zhì)體介導(dǎo)的TGF-β1質(zhì)粒及其空載體質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染大鼠第三代BMSCs,轉(zhuǎn)染48h后行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(
13、reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)檢測TGF-β1 mRNA的表達水平。RT-PCR結(jié)果表明A組TGF-β1 mRNA的表達水平高于B組和C組(P<0.01)。
5組織工程化培養(yǎng)模型體外培養(yǎng)3、6、9、12d后分別行酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immnosorbent assay,ELISA)法檢測培養(yǎng)液上清中TGF-β1蛋白的含量,結(jié)
14、果顯示:四個時點,A組的TGF-β1分泌量都高于B組和C組(P<0.05),同時A組TGF-β1單日分泌量呈逐漸下降趨勢,B組和C組TGF-β1單日分泌量則始終呈低表達趨勢。
6組織工程化培養(yǎng)模型體外培養(yǎng)3、6、9、12d后分別利用阿利新藍法測定培養(yǎng)液上清中酸性糖胺多糖的含量。結(jié)果顯示:3、6、12d三個時點,A組培養(yǎng)液上清中GAG含量明顯高于B組和C組(P<0.01)。同時A組GAG單日分泌量呈逐漸上升趨勢,B組和C組GAG
15、單日分泌量則始終呈低表達趨勢。證實A組細胞出現(xiàn)成軟骨分化趨勢。
7組織工程化培養(yǎng)模型體外培養(yǎng)2周后提取總RNA,行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測支架細胞復(fù)合體中Ⅱ型膠原、Sox9 mRNA的表達水平。結(jié)果顯示:A組表達Ⅱ型膠原、Sox9 mRNA,B組和C組則無Ⅱ型膠原和Sox9兩種軟骨細胞特異性標志基因的表達。
16、 結(jié)論:
1密度梯度離心法可以成功分離大鼠BMSCs,所分離的BMSCs具有多向分化潛能。
2蠶絲蛋白和殼聚糖均為天然生物材料,原料易得,生物相容性好,本研究將蠶絲蛋白與殼聚糖復(fù)合,通過強烈的氫鍵和離子鍵作用,改善其理化性能,并開發(fā)出適合于軟骨組織工程領(lǐng)域的蠶絲蛋白-殼聚糖復(fù)合支架材料。
3脂質(zhì)體法成功將TGF-β1基因真核表達型質(zhì)粒及其空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到生長狀態(tài)良好的第三代BMSCs,然后將轉(zhuǎn)染48h后的第
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