妊娠早期亞臨床甲減左旋甲狀腺素干預(yù)對(duì)后代神經(jīng)智力發(fā)育影響的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、亞臨床甲狀腺功能減退癥(Subclinical hypothyroidism,SCH)又稱亞臨床甲減,在一般人群的總體患病率是4-10％,妊娠期婦女患病率為5％。母體甲減,特別是碘缺乏病引起的母體和胎兒甲減可以導(dǎo)致兒章的智力缺陷(克汀病)早已被認(rèn)識(shí)。Man及其同事首次發(fā)現(xiàn)輕微的母親甲減就可引起后代智力評(píng)分(intelligence quotient,IQ)降低,1999年Haddow和Pop等學(xué)者發(fā)現(xiàn):母親妊娠時(shí)TSH升高或FT4降低會(huì)

2、導(dǎo)致后代智力評(píng)分降低,本課題組的研究結(jié)果也提示妊娠16～20周婦女單純亞臨床甲減,單純低T4血癥和單純TPOAb陽(yáng)性皆可以使后代25-30月時(shí)的智力和運(yùn)動(dòng)發(fā)育評(píng)分降低8-10分。但是母親亞臨床甲減引起后代智力評(píng)分降低的確切機(jī)制還不清楚,本研究擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討左旋甲狀腺素(L-T4)治療孕期母鼠亞臨床甲減改善仔鼠腦發(fā)育的有效性及治療的最佳時(shí)期,并探討其作用機(jī)制。
　　 方法：75只Wistar雌鼠稱重并麻醉后行甲狀腺完全切除術(shù),

3、一個(gè)月后眶后靜脈采血檢測(cè)甲功,當(dāng)血清TSH高于正常,但TT4小于最小值(＜1μg/dL)時(shí),提示甲狀腺切除干凈,成功建立臨床甲減(CH)模型。其中15只臨床甲減鼠皮下注射含有BSA的PBS液;60只以0.95μg/100g·d劑量皮下注射L-T4,9天后眶后靜脈采血檢測(cè)甲功,當(dāng)血清TSH高于正常、而TT4水平在正常范圍時(shí),提示亞臨床甲減大鼠(SCH)模型建立成功。另15只Wistar雌鼠行甲狀腺切除假手術(shù)做為正常對(duì)照組(C),皮下注射含

4、有BSA的PBS液。各組模型建立成功后同時(shí)與正常雄鼠合籠交配,雌:雄=2:1,當(dāng)次日晨發(fā)現(xiàn)雌鼠陰道栓或陰道涂片鏡下發(fā)現(xiàn)精子確定為妊娠0天,記為E0。60只亞臨床甲減孕鼠模型,其中15只孕鼠繼續(xù)以0.95μg/100g·d劑量皮下注射L-T4至產(chǎn)后21天(P21);其余45只大鼠分別在妊娠第10天(E10)(n=15)、第13天(E13)(n=15)及第17天(E17)(n=15)開(kāi)始以1.25μg/100g·d劑量皮下注射L-T4到P2

5、1;所有母鼠分別于孕前、E10、E13、E17、E19眶后靜脈叢取血,測(cè)定血清TSH、TT4,在E14-E16天腹腔注射溴脫氧尿苷(BrdU)20mg/kg·d共3天。分娩當(dāng)天記為P0。P3時(shí)每窩仔鼠擇優(yōu)存留8只,P3、P7及P40時(shí)監(jiān)測(cè)仔鼠體重,對(duì)仔鼠腦發(fā)育相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。P45應(yīng)用水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力。Nissl染色法在光學(xué)顯微鏡下觀察大腦皮質(zhì)和海馬形態(tài)學(xué)改變;應(yīng)用免疫組化染色檢測(cè)BrdU的分布,從而判斷妊娠早期大腦皮

6、質(zhì)細(xì)胞的遷移位置;應(yīng)用免疫組化或Western blot進(jìn)行Reelin、肌腱蛋白-C、L1細(xì)胞粘附分子(L1CAM)及層粘連蛋白的半定量分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、血清TSH、TT4水平結(jié)果顯示與假手術(shù)組比較,亞臨床甲減組表現(xiàn)為血清TSH水平明顯高于同期假手術(shù)組(P＜0.05),而TT4水平未見(jiàn)明顯改變(P＞0.05),符合亞臨床甲減激素血清學(xué)改變。E10治療組、E13治療組及E17治療組在治療之前TSH升高(P＜

7、0.05),TT4無(wú)明顯改變(P＞0.05),仍處于亞臨床甲減狀態(tài),治療后孕鼠血清激素水平示TSH及TT4與正常對(duì)照組孕鼠均無(wú)明顯區(qū)別(P＞0.05)。
　　 2、發(fā)育期各組仔鼠的體重及激素水平比較P3及P7時(shí)亞臨床甲減組仔鼠體重明顯低于正常對(duì)照組仔鼠(P＜0.05),P40時(shí)與正常對(duì)照組無(wú)明顯區(qū)別(P＞0.05);與完全甲減組仔鼠相比,P3時(shí)高于完全甲減組(P＜0.05),但P7及P40時(shí)無(wú)明顯區(qū)別(P＞0.05);甲減組仔鼠

8、體形偏小,體重增加緩慢,在P3、P7及P40時(shí)體重均低于正常對(duì)照組仔鼠(P＜0.05)。E10治療組、E13治療組及E17治療組仔鼠體重在P3、P7及P40與正常對(duì)照組仔鼠均無(wú)明顯區(qū)別(P＞0.05),明顯高于完全甲減組。40日齡進(jìn)行甲功測(cè)試時(shí)發(fā)現(xiàn)各組仔鼠血清TSH激素水平及血清TT4激素水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 3、Morris水迷宮行為測(cè)定指標(biāo)分析甲減組及亞臨床甲減組逃避潛伏期與對(duì)照組比較均有顯著性差異(P

9、＜0.05),到第5天時(shí)逃避潛伏期與對(duì)照組比較仍有顯著性差異(P＜0.05)。E10治療組仔鼠及E13治療組仔鼠在各時(shí)段訓(xùn)練的逃避潛伏期與正常對(duì)照組仔鼠均無(wú)明顯差別(P＞0.05),但E17開(kāi)始治療組各時(shí)段訓(xùn)練的逃避潛伏期均比正常對(duì)照組仔鼠延長(zhǎng),差異顯著(P＜0.05)。
　　 4、各組仔鼠皮質(zhì)及海馬病理形態(tài)學(xué)變化Nissl染色光鏡結(jié)果顯示7日齡正常對(duì)照組仔鼠軀體感覺(jué)皮質(zhì)各層神經(jīng)細(xì)胞排列致密整齊,Ⅳ層見(jiàn)典型的桶狀結(jié)構(gòu),Ⅴ層見(jiàn)大的

10、錐體細(xì)胞,各細(xì)胞層間界限清晰,亞臨床甲減組及完全甲減組仔鼠軀體感覺(jué)皮質(zhì)則無(wú)這些典型的表現(xiàn)。E17治療組也是如此,但E10開(kāi)始治療及E13開(kāi)始治療組仔鼠表現(xiàn)與正常對(duì)照組仔鼠無(wú)明顯差別:40日齡仔鼠也有類似結(jié)果。皮質(zhì)厚度測(cè)量結(jié)果顯示P7時(shí)各組仔鼠之間均無(wú)明顯差別(P＞0.05),P40時(shí)甲減組仔鼠皮質(zhì)比正常對(duì)照組仔鼠薄(P=0.000)。正常對(duì)照組仔鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層界限清晰,E10治療組及E13治療組仔鼠表現(xiàn)與正常對(duì)照組仔鼠無(wú)明顯差

11、別,E17治療組、亞臨床甲減組及完全甲減組仔鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元層間界限不清。亞臨床甲減組及完全甲減組仔鼠海馬錐體層(py)增厚,輻射層(ra)較薄(P＜0.05),E17治療組與之類似,但E10治療組及E13治療則與正常對(duì)照組相似,厚度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 5、大腦細(xì)胞遷移情況亞臨床甲減組及臨床甲減組仔鼠BrdU標(biāo)記的細(xì)胞分布更廣泛,白質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)BrdU標(biāo)記的細(xì)胞,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示Ⅵ層及皮質(zhì)下白質(zhì)內(nèi)BrdU標(biāo)記細(xì)胞的

12、數(shù)量明顯多于正常對(duì)照組仔鼠,Ⅱ-Ⅲ層減少(P＜0.05),神經(jīng)細(xì)胞移行于與出生日期不相應(yīng)的異常位置;E17治療組仔鼠表現(xiàn)與亞臨床甲減組及完全甲減組仔鼠相似,但E10治療組及E13治療組則與正常對(duì)照組仔鼠相似(P＞0.05)。
　　 6、各組仔鼠大腦Reelin及肌腱蛋白-C表達(dá)量的變化免疫組化染色發(fā)現(xiàn):7日齡及40日齡甲減組、亞臨床甲減組及E17治療組仔鼠軀體感覺(jué)皮質(zhì)及海馬Reelin的表達(dá)量明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.05),

13、E10及E13治療組與正常對(duì)照組無(wú)明顯區(qū)別。7日齡甲減組、亞臨床甲減組及E17治療組仔鼠軀體感覺(jué)皮質(zhì)肌腱蛋白-C表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05);40日齡各組之間均無(wú)明顯區(qū)別。
　　 7、仔鼠皮質(zhì)和海馬組織的L1CAM、層粘連蛋白(Laminin)水平Western blotting檢測(cè)皮質(zhì)結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,E17治療組、亞臨床甲減組及甲減組仔鼠皮質(zhì)L1CAM三個(gè)主要多肽的蛋白表達(dá)量在出生后3d(P3)明顯升高

14、(P＜0.05),但E10及E13治療組則與正常對(duì)照組無(wú)區(qū)別;P7時(shí)甲減組L1CAM140kDa多肽的表達(dá)明顯多于正常對(duì)照組(P＜0.05),其他各組間無(wú)差異;P40時(shí)L1CAM的三個(gè)主要多肽在各組間均無(wú)明顯差異。海馬檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,甲減組仔鼠皮質(zhì)L1CAM三個(gè)多肽蛋白表達(dá)量在出生后3d(P3)明顯升高,E10、E13、E17及亞臨床甲減組L1CAM三個(gè)多肽與正常對(duì)照組之間均無(wú)明顯區(qū)別(P＞0.05);P7及P40時(shí)海馬

15、L1CAM的三個(gè)主要多肽在各組間的表達(dá)均無(wú)明顯差異。皮質(zhì)及海馬檢測(cè)結(jié)果顯示層粘連蛋白在各組之間均無(wú)明顯區(qū)別(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、孕期母鼠亞臨床甲減會(huì)影響后代的正常發(fā)育,孕第10天(E10)、E13和E17開(kāi)始應(yīng)用L-T4治療母鼠至甲功正常,都可以促進(jìn)仔鼠體重的正常發(fā)育。
　　 2、母體甲減及亞臨床甲減可以導(dǎo)致后代學(xué)習(xí)記憶能力的嚴(yán)重?fù)p傷,若在E13之前進(jìn)行L-T4治療則對(duì)后代仔鼠行為學(xué)測(cè)定指標(biāo)