妊娠早期亞臨床甲減左旋甲狀腺素干預對后代神經(jīng)智力發(fā)育影響的動物實驗研究.pdf

1、亞臨床甲狀腺功能減退癥(Subclinical hypothyroidism,SCH)又稱亞臨床甲減,在一般人群的總體患病率是4-10％,妊娠期婦女患病率為5％。母體甲減,特別是碘缺乏病引起的母體和胎兒甲減可以導致兒章的智力缺陷(克汀病)早已被認識。Man及其同事首次發(fā)現(xiàn)輕微的母親甲減就可引起后代智力評分(intelligence quotient,IQ)降低,1999年Haddow和Pop等學者發(fā)現(xiàn):母親妊娠時TSH升高或FT4降低會

2、導致后代智力評分降低,本課題組的研究結(jié)果也提示妊娠16～20周婦女單純亞臨床甲減,單純低T4血癥和單純TPOAb陽性皆可以使后代25-30月時的智力和運動發(fā)育評分降低8-10分。但是母親亞臨床甲減引起后代智力評分降低的確切機制還不清楚,本研究擬通過動物實驗探討左旋甲狀腺素(L-T4)治療孕期母鼠亞臨床甲減改善仔鼠腦發(fā)育的有效性及治療的最佳時期,并探討其作用機制。
　　 方法：75只Wistar雌鼠稱重并麻醉后行甲狀腺完全切除術(shù),

3、一個月后眶后靜脈采血檢測甲功,當血清TSH高于正常,但TT4小于最小值(＜1μg/dL)時,提示甲狀腺切除干凈,成功建立臨床甲減(CH)模型。其中15只臨床甲減鼠皮下注射含有BSA的PBS液;60只以0.95μg/100g·d劑量皮下注射L-T4,9天后眶后靜脈采血檢測甲功,當血清TSH高于正常、而TT4水平在正常范圍時,提示亞臨床甲減大鼠(SCH)模型建立成功。另15只Wistar雌鼠行甲狀腺切除假手術(shù)做為正常對照組(C),皮下注射含

4、有BSA的PBS液。各組模型建立成功后同時與正常雄鼠合籠交配,雌:雄=2:1,當次日晨發(fā)現(xiàn)雌鼠陰道栓或陰道涂片鏡下發(fā)現(xiàn)精子確定為妊娠0天,記為E0。60只亞臨床甲減孕鼠模型,其中15只孕鼠繼續(xù)以0.95μg/100g·d劑量皮下注射L-T4至產(chǎn)后21天(P21);其余45只大鼠分別在妊娠第10天(E10)(n=15)、第13天(E13)(n=15)及第17天(E17)(n=15)開始以1.25μg/100g·d劑量皮下注射L-T4到P2

5、1;所有母鼠分別于孕前、E10、E13、E17、E19眶后靜脈叢取血,測定血清TSH、TT4,在E14-E16天腹腔注射溴脫氧尿苷(BrdU)20mg/kg·d共3天。分娩當天記為P0。P3時每窩仔鼠擇優(yōu)存留8只,P3、P7及P40時監(jiān)測仔鼠體重,對仔鼠腦發(fā)育相關(guān)的指標進行檢測。P45應用水迷宮實驗檢測仔鼠學習記憶能力。Nissl染色法在光學顯微鏡下觀察大腦皮質(zhì)和海馬形態(tài)學改變;應用免疫組化染色檢測BrdU的分布,從而判斷妊娠早期大腦皮

6、質(zhì)細胞的遷移位置;應用免疫組化或Western blot進行Reelin、肌腱蛋白-C、L1細胞粘附分子(L1CAM)及層粘連蛋白的半定量分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、血清TSH、TT4水平結(jié)果顯示與假手術(shù)組比較,亞臨床甲減組表現(xiàn)為血清TSH水平明顯高于同期假手術(shù)組(P＜0.05),而TT4水平未見明顯改變(P＞0.05),符合亞臨床甲減激素血清學改變。E10治療組、E13治療組及E17治療組在治療之前TSH升高(P＜

7、0.05),TT4無明顯改變(P＞0.05),仍處于亞臨床甲減狀態(tài),治療后孕鼠血清激素水平示TSH及TT4與正常對照組孕鼠均無明顯區(qū)別(P＞0.05)。
　　 2、發(fā)育期各組仔鼠的體重及激素水平比較P3及P7時亞臨床甲減組仔鼠體重明顯低于正常對照組仔鼠(P＜0.05),P40時與正常對照組無明顯區(qū)別(P＞0.05);與完全甲減組仔鼠相比,P3時高于完全甲減組(P＜0.05),但P7及P40時無明顯區(qū)別(P＞0.05);甲減組仔鼠

8、體形偏小,體重增加緩慢,在P3、P7及P40時體重均低于正常對照組仔鼠(P＜0.05)。E10治療組、E13治療組及E17治療組仔鼠體重在P3、P7及P40與正常對照組仔鼠均無明顯區(qū)別(P＞0.05),明顯高于完全甲減組。40日齡進行甲功測試時發(fā)現(xiàn)各組仔鼠血清TSH激素水平及血清TT4激素水平均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 3、Morris水迷宮行為測定指標分析甲減組及亞臨床甲減組逃避潛伏期與對照組比較均有顯著性差異(P

9、＜0.05),到第5天時逃避潛伏期與對照組比較仍有顯著性差異(P＜0.05)。E10治療組仔鼠及E13治療組仔鼠在各時段訓練的逃避潛伏期與正常對照組仔鼠均無明顯差別(P＞0.05),但E17開始治療組各時段訓練的逃避潛伏期均比正常對照組仔鼠延長,差異顯著(P＜0.05)。
　　 4、各組仔鼠皮質(zhì)及海馬病理形態(tài)學變化Nissl染色光鏡結(jié)果顯示7日齡正常對照組仔鼠軀體感覺皮質(zhì)各層神經(jīng)細胞排列致密整齊,Ⅳ層見典型的桶狀結(jié)構(gòu),Ⅴ層見大的

10、錐體細胞,各細胞層間界限清晰,亞臨床甲減組及完全甲減組仔鼠軀體感覺皮質(zhì)則無這些典型的表現(xiàn)。E17治療組也是如此,但E10開始治療及E13開始治療組仔鼠表現(xiàn)與正常對照組仔鼠無明顯差別:40日齡仔鼠也有類似結(jié)果。皮質(zhì)厚度測量結(jié)果顯示P7時各組仔鼠之間均無明顯差別(P＞0.05),P40時甲減組仔鼠皮質(zhì)比正常對照組仔鼠薄(P=0.000)。正常對照組仔鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞層界限清晰,E10治療組及E13治療組仔鼠表現(xiàn)與正常對照組仔鼠無明顯差

11、別,E17治療組、亞臨床甲減組及完全甲減組仔鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元層間界限不清。亞臨床甲減組及完全甲減組仔鼠海馬錐體層(py)增厚,輻射層(ra)較薄(P＜0.05),E17治療組與之類似,但E10治療組及E13治療則與正常對照組相似,厚度無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 5、大腦細胞遷移情況亞臨床甲減組及臨床甲減組仔鼠BrdU標記的細胞分布更廣泛,白質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)BrdU標記的細胞,統(tǒng)計結(jié)果顯示Ⅵ層及皮質(zhì)下白質(zhì)內(nèi)BrdU標記細胞的

12、數(shù)量明顯多于正常對照組仔鼠,Ⅱ-Ⅲ層減少(P＜0.05),神經(jīng)細胞移行于與出生日期不相應的異常位置;E17治療組仔鼠表現(xiàn)與亞臨床甲減組及完全甲減組仔鼠相似,但E10治療組及E13治療組則與正常對照組仔鼠相似(P＞0.05)。
　　 6、各組仔鼠大腦Reelin及肌腱蛋白-C表達量的變化免疫組化染色發(fā)現(xiàn):7日齡及40日齡甲減組、亞臨床甲減組及E17治療組仔鼠軀體感覺皮質(zhì)及海馬Reelin的表達量明顯低于正常對照組(P＜0.05),

13、E10及E13治療組與正常對照組無明顯區(qū)別。7日齡甲減組、亞臨床甲減組及E17治療組仔鼠軀體感覺皮質(zhì)肌腱蛋白-C表達量明顯高于正常對照組(P＜0.05);40日齡各組之間均無明顯區(qū)別。
　　 7、仔鼠皮質(zhì)和海馬組織的L1CAM、層粘連蛋白(Laminin)水平Western blotting檢測皮質(zhì)結(jié)果顯示,與正常對照組比較,E17治療組、亞臨床甲減組及甲減組仔鼠皮質(zhì)L1CAM三個主要多肽的蛋白表達量在出生后3d(P3)明顯升高

14、(P＜0.05),但E10及E13治療組則與正常對照組無區(qū)別;P7時甲減組L1CAM140kDa多肽的表達明顯多于正常對照組(P＜0.05),其他各組間無差異;P40時L1CAM的三個主要多肽在各組間均無明顯差異。海馬檢測結(jié)果顯示,與正常對照組比較,甲減組仔鼠皮質(zhì)L1CAM三個多肽蛋白表達量在出生后3d(P3)明顯升高,E10、E13、E17及亞臨床甲減組L1CAM三個多肽與正常對照組之間均無明顯區(qū)別(P＞0.05);P7及P40時海馬

15、L1CAM的三個主要多肽在各組間的表達均無明顯差異。皮質(zhì)及海馬檢測結(jié)果顯示層粘連蛋白在各組之間均無明顯區(qū)別(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、孕期母鼠亞臨床甲減會影響后代的正常發(fā)育,孕第10天(E10)、E13和E17開始應用L-T4治療母鼠至甲功正常,都可以促進仔鼠體重的正常發(fā)育。
　　 2、母體甲減及亞臨床甲減可以導致后代學習記憶能力的嚴重損傷,若在E13之前進行L-T4治療則對后代仔鼠行為學測定指標