Toll樣受體4介導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞對胰腺癌增殖、侵襲作用的機(jī)制研究.pdf

1、本文對Toll樣受體4介導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞對胰腺癌增殖、侵襲作用的機(jī)制進(jìn)行了研究。本研究分為三個部分：
　　第一部分：TLR4介導(dǎo)的TAM對胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲的作用。
　　目的：研究TAM表面的TLR4對胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響的調(diào)節(jié)。
　　方法：從C3H/HeN（TL R4野生型小鼠）及C3H/HeJ（TLR4缺失型小鼠）的股骨中獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，體外誘導(dǎo)成為TAM后，分別與小鼠胰腺癌細(xì)胞PAN02共培養(yǎng)

2、24小時，通過CCK-8法檢測PAN02的增殖能力，流式細(xì)胞學(xué)法檢測PAN02的細(xì)胞周期及凋亡，Transwell法檢測PAN02的侵襲能力的變化。
　　結(jié)果：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)后，通過流式細(xì)胞儀檢測顯示具有巨噬細(xì)胞表面抗體表達(dá)特點(diǎn)（CD11b、F4/80高表達(dá)，CD11c低表達(dá)）的細(xì)胞約占總細(xì)胞的84.01％，RT-PC R法檢測顯示該群細(xì)胞IL-10、 CCL-17、Arg-1、Chi313的mR NA的相對表達(dá)量量較對

3、照組明顯增高，符合TAM的分子表達(dá)特性。TAM和PAN02共培養(yǎng)后，CCK-8法檢測與TLR4缺失TAM共培養(yǎng)的PAN02細(xì)胞增殖能力明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；流式細(xì)胞儀檢測顯示TLR4缺失組的PAN02細(xì)胞凋亡較對照組增加（14.81%±0.4% vs.11.07%±0.25%, p<0.01）；S期比例例顯著減少（30.20%vs.35.12%，p<0.01），而G0/G1期比例例明顯增加；與TLR4缺失T

4、AM共培養(yǎng)的PAN02細(xì)胞的侵襲能力較對照組顯著降低（61±1.5個細(xì)胞/HP vs.121±2個細(xì)胞/H P），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01）。
　　結(jié)論：成功在體外誘導(dǎo)TAM，TL R4介導(dǎo)了了TAM對PAN02的增殖能力和侵襲能力的影響。
　　第二部分：胰腺癌細(xì)胞通過TLR4活化TAM并分泌泌TNF-α。
　　目的：探討胰腺癌細(xì)胞如何活化TAM表面TL R4的配體，TL R4引起的信號通路路的激活，后續(xù)效應(yīng)分

5、子的釋放。
　　方法：通過細(xì)胞免疫熒光法及Western bolt法檢測PAN02分泌泌的TLR4配體， Western blot法檢測TAM內(nèi)NF-κB亞基p65的含量量，RT-PCR法檢測TNF-α的mRNA相對表達(dá)量量，ELISA法檢測細(xì)胞外TNF-α的分泌泌水平。
　　結(jié)果：細(xì)胞免疫熒光法證明PAN02細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)HSP60、HSP70、HSP90， Western bolt法證明HSP60、HSP70、HSP90分

6、泌泌到胞外，Western blot法檢測顯示TLR4缺失組TAM內(nèi)NF-κB亞基p65的相對表達(dá)量量較對照組顯著降低（p<0.05）；RT-PC R法檢測顯示TLR4缺失組TAM內(nèi)TNF-αmRN A的相對表達(dá)量量顯著降低（p<0.05）；ELISA法檢測顯示TLR4缺失組TAM分泌泌TNF-α水平顯著降低（p<0.05）。
　　結(jié)論：PAN02通過分泌泌HSP60、HSP70、HSP90等TLR4配體，激活TAM表面TL R4

7、，引起NF-κB信號通路路的激活，并促進(jìn)下游TNF-α的基因表達(dá)增加，分泌泌增多。
　　第三部分：TNF-α促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞內(nèi)NF-κB、HIF-1α的表達(dá)。
　　目的：探討被胰腺癌細(xì)胞活化的TAM如何反饋?zhàn)饔靡认侔┘?xì)胞，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。
　　方法：通過雙熒光素酶報告基因法檢測PAN02內(nèi)NF-κB的活性，RT-PCR法檢測HIF-1α的mRNA相對表達(dá)量量，Western bolt法檢測HIF-1α的蛋白質(zhì)

8、表達(dá)水平。
　　結(jié)果：雙熒光素酶報告基因法顯示與TLR4缺失TAM共培養(yǎng)的PAN02內(nèi)NF-κB的活性較對照組顯著降低（p<0.05）；RT-PC R法檢測顯示TLR4缺失組PAN02內(nèi)HIF-1αmRNA的相對表達(dá)量量顯著降低（p<0.05）；Western blot法檢測顯示TLR4缺失組PAN02內(nèi)HIF-1α的相對表達(dá)量量較對照組顯著降低（p<0.05）；在對照組中添加TNF-α中和性抗體后，取得與TLR4缺失組一致的結(jié)果