右歸丸對腎陽虛型慢性腎衰大鼠腎臟AQP2表達影響及機制研究.pdf

1、目的：
　　 水代謝平衡紊亂是慢性腎功能衰竭（CRF）最常見的臨床表現(xiàn)之一，往往在CRF早期就出現(xiàn)，是能夠?qū)е履I功能急劇惡化的重要危險因素。因此及時糾正CRF早期水代謝平衡紊亂，對改善腎功能，延緩CRF病程進展，提高患者生存質(zhì)量，具有重要意義。中醫(yī)認為CRF基本病機屬于腎陽虛，臨床上采用溫補腎陽方法治療CRF也取得了較好的效果，但機理尚未闡明。本研究以分子生物學、形態(tài)學等檢測技術(shù)，觀察了溫補腎陽傳統(tǒng)名方右歸丸對腎陽虛型慢性腎衰模

2、型大鼠腎組織AQP2表達的影響，以及對血中AVP水平、腎組織中血管緊張素Ⅱ（AⅡ）水平、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平、腎組織中血管緊張素ⅡAT1受體（AT1R）表達、環(huán)氧合酶2（COX-2）表達、蛋白激酶A（PKA）表達的影響，旨在從分子水平探討右歸丸治療慢性腎衰水液代謝平衡紊亂的藥理作用機制，并為腎陽虛證“氣化不利”的病理生理學機制提供實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1．動物造模及給藥
　　 健康雄性Wistar

3、大鼠隨機分為對照組、模型組、右歸丸組及替米沙坦組。模型組、右歸丸組及替米沙坦組大鼠每日上午按200mg/kg/d給予2％的腺嘌呤混懸液灌服，建立腎陽虛型慢性腎衰大鼠模型，對照組大鼠給予相應量蒸餾水灌胃，連續(xù)21天。從造模的第3周開始，右歸丸組及替米沙坦組大鼠每日上午灌服腺嘌呤的同時，開始每日下午分別灌服右歸丸（按3.6 g/kg/d）及替米沙坦（按5.4mg/Kg/d），對照組及模型組大鼠給予相應量蒸餾水灌胃，連續(xù)21天。
　　

4、 2．指標觀察
　　 實驗過程中，觀察大鼠的一般狀態(tài)、體重、尿量、尿比重、血Scr、BUN含量及腎組織病理形態(tài)的變化；采用免疫組化及Western blot方法測定大鼠腎組織AQP2表達；采用放射性免疫方法檢測大鼠血AVP含量、腎組織AⅡ及cAMP含量；采用免疫組化方法檢測腎組織PKA表達；利用Western blot方法測定大鼠腎組織AT1受體、COX-2蛋白表達，
　　 3．統(tǒng)計學處理
　　 計量資料用x±S

5、D表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計學軟件進行ANOVA（完全隨機設計的單因素方差分析）統(tǒng)計方法處理，以P<0.05為有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 1．右歸丸對腎陽虛型慢性腎衰大鼠腎功能影響
　　 結(jié)果顯示，模型組大鼠出現(xiàn)畏寒肢冷、食量減少、體重下降、活動減少；與對照組比較，尿量明顯增加，尿比重下降，血Scr及BUN含量顯著增高（P<0.05），腎組織光鏡觀察可見腎小球囊腔擴大，間質(zhì)纖維組織增生及大量炎細胞浸潤

6、，腎小管呈代償性擴張。與模型組比較，右歸丸組大鼠攝食較好、活動力較強、被毛較光澤、反應靈敏、體重均有不同程度增加，尿量減少、尿比重增加、血Scr及BUN含量下降（P<0.05）、腎組織光鏡觀察可見病理損傷明顯減輕。
　　 2．右歸丸對腎陽虛型慢性腎衰大鼠腎組織AQP2表達影響
　　 免疫組化方法檢測表明：模型組大鼠腎臟集合管上皮細胞胞膜胞漿AQP2的表達較對照組明顯減弱，表現(xiàn)為細胞胞膜和胞漿棕黃色顆粒明顯減少，顏色明顯變

7、淺，圖像分析表明：模型組大鼠腎臟集合管上皮細胞AQP2陽性表達累積光密度值明顯低子對照組（P<0.05）；右歸丸組大鼠腎臟集合管上皮細胞胞膜胞漿AQP2的表達較模型組明顯增強，表現(xiàn)為細胞胞膜胞漿棕黃色顆粒明顯增多，顏色明顯加深，圖像分析結(jié)果顯示：右歸丸組大鼠腎臟集合管上皮細胞AQP2陽性表達累積光密度值明顯高于模型組（P<0.05）。western blot方法檢測顯示：模型組大鼠腎組織AQP2表達下降，表現(xiàn)為條帶窄，密度小，顏色淺。圖

8、像分析結(jié)果顯示：模型組大鼠AQP2表達條帶灰度值顯著低于對照組；右歸丸組大鼠腎組織AQP2蛋白表達增加，表現(xiàn)為條帶寬，密度大，顏色深，圖像分析結(jié)果顯示：右歸丸組大鼠腎組織AQP2表達條帶灰度值顯著高于模型組（P<0.05）。
　　 3．右歸丸對腎陽虛型慢性腎衰大鼠血中AVP含量、腎組織中AⅡ、cAMP含量、AT1R表達等影響。
　　 結(jié)果表明，三組大鼠血中AVP含量無顯著性差異（P>0.05）。與對照組比較，模型組大鼠腎

9、組織AⅡ含量、AT!R及COX-2表達明顯升高、cAMP含量及PKA表達顯著下降（P<0.05）；與模型組比較，右歸丸組大鼠腎組織中AⅡ含量、AT!R及COX-2表達明顯降低、cAMP含量及PKA表達增加（P<0.05）。
　　 結(jié)果顯示，慢性腎衰發(fā)生水代謝平衡紊亂的可能機制之一為腎臟集合管AQP2表達下降。中醫(yī)理論的腎主水功能，主要體現(xiàn)在依靠腎的氣化作用“升清降濁”以維持機體水液的動態(tài)平衡，當腎陽虛氣化功能減退時則出現(xiàn)水液代謝

10、障礙。由此推測：腎臟的氣化功能減退的實質(zhì)之一，可能通過AQP2表達的下調(diào)，影響了腎臟的重吸收功能。而腎組織AQP2表達下降的可能機制為，通過腎組織中AⅡ含量升高、AT1R及COX-2表達增加，導致腎組織中cAMP含量及PKA表達降低，使AQP2在腎臟的表達下降；采用右歸丸治療，通過溫補腎陽，使腎組織中AⅡ含量、AT1R及COX-2表達降低，增加腎組織中cAMP含量及PKA表達，導致腎臟AQP2的表達增加，改善慢性腎衰水代謝平衡紊亂，保護

11、腎功能，延緩慢性腎衰進展。
　　 結(jié)論：
　　 1．腎陽虛型慢性腎衰模型大鼠尿量增加，尿比重降低：血Scr及BUN水平增加：腎組織病理可見明顯損傷；右歸丸治療能夠明顯改善上述病理變化。
　　 2．腎陽虛型慢性腎衰模型大鼠腎組織AQP2表達下調(diào)；右歸丸治療可使AQP2表達上調(diào)。
　　 3．右歸丸對腎陽虛型慢性腎衰模型大鼠血AVP含量無顯著影響。
　　 4．腎陽虛型慢性腎衰大鼠模型腎組織中AⅡ含量升高