低氧對(duì)大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的影響及機(jī)制.pdf

1、目的： 慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓（CHPH）是大部分慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者最終發(fā)展成為肺心病而死亡的主要原因，關(guān)于其發(fā)病機(jī)制已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，臨床以此為基礎(chǔ)的治療也取得了一定的療效，然而，臨床治療CHPH的手段仍然有限，療效依然欠佳。肺血管低氧早期（急性低氧）的收縮反應(yīng)和慢性低氧性肺血管結(jié)構(gòu)重建是CHPH發(fā)生的主要機(jī)制，造成CHPH的這兩個(gè)主要環(huán)節(jié)不僅發(fā)生在肺動(dòng)脈，而且包括肺靜脈。盡管關(guān)于肺動(dòng)脈急性低氧性收縮反應(yīng)和慢性

2、低氧性肺血管結(jié)構(gòu)重建的機(jī)制已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，然而，關(guān)于肺靜脈的此類研究卻少有報(bào)道。大量的研究證明：細(xì)胞內(nèi)Ca2+在血管平滑肌細(xì)胞的收縮和增生的復(fù)雜機(jī)制中起至關(guān)重要的作用。但是，關(guān)于肺靜脈平滑肌細(xì)胞（PVSMC）Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及低氧對(duì)PVSMC細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度（[Ca2+]i）作用的研究卻鮮有報(bào)道，我們推測(cè)：低氧可能通過某些機(jī)制使PVSMC的[Ca2+]i改變，參與CHPH的發(fā)生、發(fā)展過程。因此，我們建立了大鼠遠(yuǎn)端PVSMC原代

3、培養(yǎng)模型及CHPH大鼠模型，對(duì)急慢性低氧誘導(dǎo)大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌[Ca2+]i改變的作用及機(jī)理進(jìn)行了研究。從以往研究甚少的肺靜脈方面來闡述CHPH發(fā)生的可能機(jī)制，為尋找有效的防治肺動(dòng)脈高壓的方法打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。 方法： 一、急性低氧對(duì)大鼠遠(yuǎn)端PVSMC[Ca2+]i的影響：首先利用膠原酶消化法分離、原代培養(yǎng)大鼠遠(yuǎn)端PVSMC，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、平滑肌細(xì)胞α-actin免疫熒光和western-blot免疫印跡分析以

4、及[Ca2+]i對(duì)高鉀KRBS溶液的反應(yīng)來鑒定PVSMC，從而建立大鼠遠(yuǎn)端PVSMC原代培養(yǎng)模型。然后利用InCyte細(xì)胞內(nèi)鈣濃度檢測(cè)系統(tǒng)，觀測(cè)急性低氧對(duì)大鼠遠(yuǎn)端PVSMC[Ca2+]i的影響 二、急性低氧對(duì)大鼠遠(yuǎn)端PVSMC[Ca2+]i影響的機(jī)制：1、利用InCyte細(xì)胞內(nèi)鈣濃度檢測(cè)系統(tǒng)，觀測(cè)電壓依賴性鈣通道（VDCC）拮抗劑硝苯地平對(duì)急性低氧誘導(dǎo)大鼠遠(yuǎn)端PVSMC[Ca2+]i改變的干預(yù)作用，明確是否有VDCC以外的鈣通道

5、參與急性低氧誘導(dǎo)的大鼠遠(yuǎn)端PVSMC[Ca2+]i改變過程。2、分離大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌，原代培養(yǎng)大鼠遠(yuǎn)端PVSMC，通過熒光定量PCR和western-blot免疫印跡分析來檢測(cè)經(jīng)典瞬時(shí)受體電位（TRPC）蛋白在大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌和培養(yǎng)的大鼠遠(yuǎn)端PVSMC的mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)，明確大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌是否表達(dá)TRPC蛋白。3、利用InCyte細(xì)胞內(nèi)鈣濃度檢測(cè)系統(tǒng)，通過恢復(fù)細(xì)胞外鈣法、錳熒光焠滅法，并利用儲(chǔ)量操縱性鈣通道（S

6、OCC）拮抗劑SKF-96365和NiCl2，在大鼠遠(yuǎn)端PVSMC上檢測(cè)Ca2+通過由TRPC蛋白組成的SOCC而形成的儲(chǔ)量操作性鈣內(nèi)流（SOCE），明確大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌是否存在SOCE。4、利用InCyte細(xì)胞內(nèi)鈣濃度檢測(cè)系統(tǒng)，通過恢復(fù)細(xì)胞外鈣法、錳熒光焠滅法，并利用SOCC拮抗劑SKF-96365和NiCl2觀測(cè)急性低氧對(duì)大鼠遠(yuǎn)端PVSMC的SOCE的影響，明確SOCE在急性低氧引起的大鼠遠(yuǎn)端PVSMC[Ca2+]i改變中的作用

7、。 三、慢性低氧對(duì)大鼠遠(yuǎn)端PVSMC的[Ca2+]i的影響：首先，通過慢性持續(xù)低氧（10%O2）條件下飼養(yǎng)大鼠3周建立CHPH大鼠模型；然后，分離正常大鼠和CHPH大鼠遠(yuǎn)端PVSMC；最后，利用InCyte細(xì)胞內(nèi)鈣濃度檢測(cè)系統(tǒng)，分別檢測(cè)正常大鼠和CHPH大鼠遠(yuǎn)端PVSMC的[Ca2+]i，從而明確慢性低氧對(duì)大鼠遠(yuǎn)端PVSMC的[Ca2+]i的影響。 四、慢性低氧對(duì)大鼠遠(yuǎn)端PVSMC的[Ca2+]i的影響的機(jī)制：1、分離正

8、常大鼠和CHPH大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌，通過熒光定量PCR和Western-blot免疫印跡分析來檢測(cè)TRPC在正常大鼠和CHPH大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌的表達(dá)，明確慢性低氧對(duì)大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌TRPC表達(dá)的影響。2、分離正常大鼠和CHPH大鼠遠(yuǎn)端PVSMC，利用InCyte細(xì)胞內(nèi)鈣濃度檢測(cè)系統(tǒng)，首先分別檢測(cè)由環(huán)匹阿尼酸（CPA）誘導(dǎo)的正常大鼠和CHPH大鼠遠(yuǎn)端PVSMC的[Ca2+]i變化，然后分別檢測(cè)由CPA誘導(dǎo)的正常大鼠和CHPH大鼠

9、遠(yuǎn)端PVSMC的錳熒光焠滅，從而明確慢性低氧對(duì)大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌SOCE的影響；接著分別檢測(cè)由油?；阴８视停∣AG）誘導(dǎo)的正常大鼠和CHPH大鼠遠(yuǎn)端PVSMC的[Ca2+]i變化，最后分別檢測(cè)由OAG誘導(dǎo)的正常大鼠和CHPH大鼠遠(yuǎn)端PVSMC的錳熒光焠滅，從而明確慢性低氧對(duì)大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌由受體操縱性鈣通道（ROCC）介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流的影響。 結(jié)果： 一、急性低氧對(duì)大鼠遠(yuǎn)端PVSMC[Ca2+]i的影響：

10、 1、成功建立了大鼠遠(yuǎn)端PVSMC原代培養(yǎng)模型，原代培養(yǎng)的大鼠遠(yuǎn)端PVSMC不僅表現(xiàn)出典型的血管平滑肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)特征，而且具有完好的生理學(xué)功能。 2、急性低氧使大鼠遠(yuǎn)端PVSMC[Ca2+]i升高。 二、急性低氧對(duì)大鼠遠(yuǎn)端PVSMC[Ca2+]i影響的機(jī)制： 1、作為VDCC拮抗劑，硝苯地平能完全阻斷高鉀KRBS溶液引起的大鼠遠(yuǎn)端PVSMC[Ca2+]i升高，卻只能部分抑制急性低氧引起的大鼠遠(yuǎn)端PVS

11、MC的[Ca2+]i升高，提示VDCC以外的鈣通道參與急性低氧引起的大鼠遠(yuǎn)端PVSMC[Ca2+]i升高。 2、在大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌組織和培養(yǎng)的PVSMC都有TRPC的mRNA表達(dá)，其中以TRPC-1、TRPC-4和TRPC-6，尤其是TRPC-1和TRPC-6的mRNA表達(dá)最強(qiáng)。Western-blot免疫印跡分析進(jìn)一步表明，在大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌組織和培養(yǎng)的PVSMC都有TRPC蛋白的表達(dá)，且尤其以TRPC-1和TRPC-

12、6的蛋白表達(dá)最強(qiáng)。 3、在去除細(xì)胞外Ca2+、用硝苯地平阻斷VDCC并用CPA使Ca2+從PVSMC肌漿網(wǎng)完全清空的條件下，恢復(fù)PVSMC細(xì)胞外Ca2+后，PVSMC[Ca2+]i可迅速顯著升高；在去除細(xì)胞外Ca2+并用硝苯地平阻斷VDCC的條件下，CPA使Mn2+引起的PVSMC的熒光焠滅增強(qiáng)；作為SOCC拮抗劑，SKF-96365和NiCl2均能明顯抑制由CPA誘導(dǎo)的PVSMC[Ca2+]i升高和錳熒光焠滅增強(qiáng)，但對(duì)高鉀KR

13、BS溶液引起的PVSMC[Ca2+]i升高沒有影響，提示大鼠遠(yuǎn)端PVSMC存在SOCE。 4、急性低氧能顯著增加由CPA誘導(dǎo)的、恢復(fù)細(xì)胞外鈣后所引起的大鼠遠(yuǎn)端PVSMC[Ca2+]i升高，并能增強(qiáng)由CPA誘導(dǎo)的大鼠遠(yuǎn)端PVSMC的錳熒光焠滅；SKF-96365和NiCl2均能明顯抑制急性低氧引起的大鼠遠(yuǎn)端PVSMC的SOCE增加；在常氧情況下，用不含CPA但含有硝苯地平的無鈣溶液孵育PVSMC，錳熒光焠滅與不加Mn2+的細(xì)胞的熒

14、光自發(fā)衰減量沒有差異；而在急性低氧情況下，用不含CPA但含有硝苯地平的無鈣溶液孵育PVSMC，錳熒光焠滅顯著增加，而且此反應(yīng)能被SKF-96365和NiCl2明顯抑制，提示急性低氧自身能誘發(fā)大鼠遠(yuǎn)端PVSMC的SOCE，而且能夠通放大SOCE，引起PVSMC[Ca2+]i升高。 三、慢性低氧對(duì)大鼠遠(yuǎn)端PVSMC的[Ca2+]i的影響： 1、成功建立CHPH大鼠模型，慢性持續(xù)性低氧3周大鼠的MPAP、RVSP、RV/（LV

15、+S）都明顯增高，肺內(nèi)血管壁明顯增厚。 2、CHPH大鼠遠(yuǎn)端PVSMC[Ca2+]i較正常大鼠明顯增高，提示慢性低氧使大鼠遠(yuǎn)端PVSMC的[Ca2+]i升高。 四、慢性低氧對(duì)大鼠遠(yuǎn)端PVSMC[Ca2+]i影響的機(jī)制： 1、熒光定量PCR和western-blot免疫印跡分析證實(shí)：在CHPH大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌組織TRPC-6蛋白的表達(dá)較正常大鼠明顯增強(qiáng)，而TRPC-1和TRPC-4蛋白的表達(dá)較正常大鼠沒有明顯改

16、變，提示慢性低氧上調(diào)大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌組織TRPC-6蛋白的表達(dá)。 2、用硝苯地平阻斷VDCC并恢復(fù)細(xì)胞外Ca2+后，CPA不僅能導(dǎo)致CHPH大鼠遠(yuǎn)端PVSMC[Ca2+]i迅速升高，而且能使正常大鼠遠(yuǎn)端PVSMC的[Ca2+]i也迅速升高，兩者升高幅度無差別；用含CPA和硝苯地平的無鈣溶液孵育細(xì)胞，CHPH大鼠遠(yuǎn)端PVSMC的錳熒光焠滅與正常大鼠的也無差別。然而，用硝苯地平阻斷VDCC并恢復(fù)細(xì)胞外Ca2+后，OAG能使正常大

17、鼠遠(yuǎn)端PVSMC的[Ca2+]i升高，而CHPH大鼠遠(yuǎn)端PVSMC由OAG誘導(dǎo)的[Ca2+]i升高較正常大鼠更明顯；同時(shí)，OAG誘導(dǎo)的錳熒光焠滅在CHPH大鼠遠(yuǎn)端PVSMC也比正常大鼠表現(xiàn)的更強(qiáng)，提示慢性低氧通過增加由ROCC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流使大鼠遠(yuǎn)端PVSMC的[Ca2+]i升高。 結(jié)論： 1、急性和慢性低氧都能使大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高。 2、大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌主要表達(dá)TRPC-1、TRPC-