基質(zhì)金屬蛋白酶-9反義寡核苷酸對(duì)肺腺癌細(xì)胞靶向治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:目前，肺癌已居人類腫瘤致死的第一名，全世界泛圍內(nèi)，科學(xué)家們一直積極采用各種方法來治療肺癌，但治療效果不能令人滿意，肺癌總的治愈率仍不足14％。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，人類對(duì)肺癌的發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制有了更深的認(rèn)識(shí)。基因治療已成為一種極具前景的新方法。反義脫氧寡核苷酸(ASODN)是一段與mRNA或DNA特異性結(jié)合，并阻斷其表達(dá)的人工合成分子。ASODN可封閉或抑制腫瘤細(xì)胞關(guān)鍵編碼基因，從而特異性抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。 反

2、義藥物是以反義核酸技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的，以治療為目的，安全有效的新型藥物。近年來，隨著對(duì)反義寡核苷酸及其結(jié)構(gòu)衍生物如硫代磷酸寡聚脫氧核苷酸反義機(jī)理的闡明，大量以病毒，癌基因，細(xì)胞活性因子及其它疾病相關(guān)蛋白為靶點(diǎn)的反義藥物相繼進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，使反義藥物的研究再次進(jìn)入蓬勃發(fā)展時(shí)期。 基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)是一組重要的含鋅離子的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解酶。目前已鑒定出約20多種MMPs，基質(zhì)金屬蛋白酶-9是其中重要的一組酶，可在

3、許多腫瘤組織中表達(dá)。還在腫瘤的凋亡，侵襲和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵性作用。 本研究采用人肺腺癌A549細(xì)胞株，運(yùn)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的NdP-9ASODN轉(zhuǎn)染該細(xì)胞，通過MTT法檢測(cè)MMP-9ASODN轉(zhuǎn)染對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；RT-PCR觀察MMP-9mRNA蛋白的表達(dá)：Western blot檢測(cè)MMP-9蛋白的改變；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MMP-9ASODN對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡比率；MTT比色法和劃痕遷移試驗(yàn)觀察MMP-9ASODN對(duì)A54

4、9細(xì)胞體外粘附以及遷移的能力；最后觀察MMP-9ASODN的體內(nèi)抑瘤效果，進(jìn)而為肺癌的基因治療提供一種新方法。肺癌靶向治療藥物的研究已進(jìn)入開發(fā)階段，目前有眾多的反義藥物已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段。本研究旨在證明反義寡核苷酸MMP-9轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)其凋亡，從而為肺癌的反義基因治療提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 1．脂質(zhì)體介導(dǎo)的寡核苷酸轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞人肺腺癌A549細(xì)胞在1640完全培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)

5、，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后接種于96孔板，分四組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即MMP-9ASODN，MMP-9SODN，脂質(zhì)體組和空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染后24h以熒光倒置顯微鏡觀察，隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)全部細(xì)胞數(shù)和發(fā)綠色熒光細(xì)胞數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染率。 2．MTT法檢測(cè)MMP-9ASODN轉(zhuǎn)染對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響ASODN轉(zhuǎn)染組加設(shè)不同濃度組即200nmol/L，400nmol/L，600nmol/L和800nmol/L的ASODN轉(zhuǎn)染。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分

6、別于轉(zhuǎn)染0 h，4h，8h，12h，24h，48h，60h后行MTT實(shí)驗(yàn)。酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)為570nm，計(jì)算A549細(xì)胞的存活率。 3．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡比率收集經(jīng)處理后的各組細(xì)胞于離心管內(nèi)，離心，洗滌，固定，染色，置流式細(xì)胞儀上，在激發(fā)波長(zhǎng)為488nm處進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞凋亡比率。 4．RT-PCR法檢測(cè)MMP-9mRNA的表達(dá)轉(zhuǎn)染后收集各組細(xì)胞，進(jìn)行RNA提取，定量后以其為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈，然后用引

7、物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。 5．Western blot檢測(cè)MMP-9蛋白的改變收集轉(zhuǎn)染24h細(xì)胞提取細(xì)胞中總蛋白，測(cè)定出樣品的蛋白質(zhì)含量，然后將蛋白質(zhì)在不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，染色，轉(zhuǎn)膜觀察結(jié)果。 6．MMP-9ASODN轉(zhuǎn)染對(duì)A549細(xì)胞體外粘附及體外遷移的影響檢測(cè)包被及水化基底膜，接種及培養(yǎng)細(xì)胞，然后MTT比色法檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞粘附率。同樣包被及水化基底膜，制備培養(yǎng)單層細(xì)胞，用人工劃痕法，在相

8、差顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)100×視野內(nèi)計(jì)算遷移到劃痕空隙中的細(xì)胞總數(shù)。 7．裸鼠模型抑瘤率觀察構(gòu)建移植瘤裸鼠模型后，MMP-9ASODN直接移植瘤內(nèi)注射，觀察其抗移植瘤生長(zhǎng)效應(yīng)，包括一般狀況，局部實(shí)體瘤生長(zhǎng)抑制率的測(cè)定以及病理組織學(xué)檢測(cè)。 結(jié)論: 1．MMP-9ASODN能夠有效地抑制肺癌A549細(xì)胞的體外增殖，作用方式呈時(shí)間及濃度依賴性。 2． MMP-9ASODN能夠下調(diào)MMP-9mRNA和MMP-9蛋