乙酰肝素酶反義寡核苷酸誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:在體外實(shí)驗(yàn)中,通過觀察乙酰肝素酶(HPA)反義寡核苷酸AS-ODN對(duì)人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞HPA-mRNA表達(dá)的影響,探討其對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用;通過觀察AS-ODN誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞的凋亡及其與凋亡調(diào)控基因p53、bcl-2、Survivin表達(dá)的關(guān)系,探討其誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的可能性及其機(jī)制;通過觀察AS-ODN對(duì)細(xì)胞間粘附分子CD54、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2以及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑

2、TIMP-2表達(dá)的影響,探討其抑制胃癌細(xì)胞的作用機(jī)制.方法:根據(jù)HPA的基因序列設(shè)計(jì)互補(bǔ)于mRNA起始密碼區(qū)的反義寡脫氧核苷酸(AS-ODN),并設(shè)計(jì)與其堿基組成相同,但堿基順序隨機(jī)排列的無義寡核苷酸(NS-ODN)作為對(duì)照.寡核苷酸序列行硫代磷酸化修飾.實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(不進(jìn)行轉(zhuǎn)染)、脂質(zhì)體對(duì)照組(轉(zhuǎn)染時(shí)只加脂質(zhì)體)、NS-ODN組(以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NS-ODN)和AS-ODN組(以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染AS-ODN).根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,在以10μl

3、/ml脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的情況下,選擇0.2、0.4、0.8μmol/L為終濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn).按照脂質(zhì)體介導(dǎo)法將HPA反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染已培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞,在37℃,5﹪CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24、48、72小時(shí)后收集細(xì)胞,用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞HPA-mRNA及p53、bcl-2的表達(dá);用倒置相差顯微鏡及掃描電鏡觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;用DNA末端原位標(biāo)記染色法(TUNEL)檢測(cè)轉(zhuǎn)染

4、前后細(xì)胞的凋亡指數(shù);用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的凋亡率、bcl-2及CD54的表達(dá);用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的增殖情況;用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞survivin、VEGF、MMP-2以及TIMP-2的表達(dá)情況.結(jié)論:1、AS-ODN轉(zhuǎn)染后SGC-7901細(xì)胞HPA-mRNA濃度下降,提示HPA反義寡核苷酸能夠通過封閉HPA的基因而下調(diào)HPA-mRNA的表達(dá).2、AS-ODN轉(zhuǎn)染后SGC-7901細(xì)胞出現(xiàn)了典型的

5、凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加,流式細(xì)胞儀直方圖上出現(xiàn)典型的亞二倍體的"凋亡峰",細(xì)胞凋亡率明顯增加,細(xì)胞增殖受到抑制,提示誘導(dǎo)凋亡是HPA反義寡核苷酸抑制胃癌細(xì)胞的機(jī)制之一.3.AS-ODN轉(zhuǎn)染后SGC-7901細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因p53的表達(dá)上調(diào),凋亡抑制基因bcl-2的表達(dá)下調(diào),而凋亡抑制基因Survivin的表達(dá)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示HPA反義寡核苷酸誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡與其上調(diào)p53的表達(dá)和下調(diào)bcl-2的表達(dá)有關(guān),而