乙酰肝素酶反義寡核苷酸抑制人胰腺癌細(xì)胞侵襲力的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、胰腺癌由于其侵襲性生物學(xué)行為而預(yù)后很差，絕大多數(shù)病人診斷明確時(shí)往往屬于病程晚期，已經(jīng)發(fā)生局部侵潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，喪失了早期根治性手術(shù)切除的機(jī)會(huì)。即使手術(shù)切除，術(shù)后復(fù)發(fā)率仍很高，預(yù)后仍未得到改善。聯(lián)合輔助治療可能給少數(shù)病人帶來生存的機(jī)會(huì)，但其療效仍未得到明確的公認(rèn)。吉西他賓是目前公認(rèn)對(duì)緩解病情唯一有效的一類細(xì)胞毒性藥物，但其改善預(yù)后和提高長(zhǎng)期生存率的效果極其有限。 反義寡核苷酸(Antisenseoligoxydeonucleotid

2、e，AS-ODN)技術(shù)是將與靶基因序列互補(bǔ)的小分子寡核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞，通過激活核酶RnaseH等機(jī)制，促使mRNA降解，抑制轉(zhuǎn)錄過程，從而阻止蛋白合成。因此，AS-ODN技術(shù)有高度的特異性。本研究采用脂質(zhì)體將靶向HPSEAS-ODN導(dǎo)入人胰腺癌細(xì)胞中，觀察其對(duì)HPSEmRNA和蛋白表達(dá)、胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)及體外侵襲力的影響；通過建立裸鼠人胰腺癌皮下移植瘤模型，觀察HPSEAS-ODN在體內(nèi)的抑瘤效果。希望通過本實(shí)驗(yàn)為下一步臨床應(yīng)用HPSEAS

3、-ODN治療胰腺癌提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分乙酰肝素酶在人胰腺癌組織中表達(dá)的意義 目的:探討乙酰肝素酶(heparanase，HPSE)在胰腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。 方法:1.采用同濟(jì)醫(yī)院病理科1998年～2003年胰腺癌切除術(shù)標(biāo)本50例，男性36例，女性14例。年齡41歲～77歲，平均63歲。高分化2例，中分化35例，低分化13例。臨床病理分期按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)聯(lián)合制定的TNM分期方案進(jìn)行，

4、其中Ⅰ期5例，Ⅱ期10例，Ⅲ期27例，Ⅳ期8例。無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例。 2.用免疫組織化學(xué)SP方法檢測(cè)50例胰腺癌切除標(biāo)本中HPSE的表達(dá)，并分析其與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。 結(jié)論:1.HPSE表達(dá)與TNM分期無(wú)明顯關(guān)系，提示早期胰腺癌組織可能高表達(dá)HPSE，這與胰腺癌的侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移特性可能有關(guān)。 2.HPSE表達(dá)與腫瘤分化程度無(wú)明顯關(guān)系，提示高分化胰腺癌有高表達(dá)HPSE的可能。因此，對(duì)高分化胰腺癌臨床上

5、也不應(yīng)輕視其侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移特性。 3.盡管有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與胰腺癌高表達(dá)HPSE無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌表達(dá)HPSE有更高的趨勢(shì)(P=0.06)。 4.檢測(cè)HPSE蛋白表達(dá)對(duì)于預(yù)測(cè)胰腺癌轉(zhuǎn)移潛能具有一定參考價(jià)值。 第二部分：乙酰肝素酶反義寡核苷酸對(duì)人胰腺癌細(xì)胞體外侵襲力的影響 目的:觀察乙酰肝素酶(heparanase，HPSE)反義寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleot

6、ide，AS-ODN)對(duì)人胰腺癌細(xì)胞系Panc-1細(xì)胞HPSE基因表達(dá)、胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)及體外侵襲力的影響，為臨床應(yīng)用HPSEAS-ODN治療胰腺癌提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:1.細(xì)胞培養(yǎng)：人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1購(gòu)于北京協(xié)和醫(yī)院。 2.合成HPSEAS-ODN，序列為：5'-GGCTTCGAGCGCAGCAGCAT-3'；無(wú)義寡核苷酸(nonsenseoligodeoxynucleotide，NS-ODN)作為對(duì)照。

7、 3.實(shí)驗(yàn)分組：AS-ODN組(用脂質(zhì)體將HPSEAS-ODN轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞)，NS-ODN組(用脂質(zhì)體將NS-ODN轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞)，對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染)。 4.逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)：檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HPSEmRNA表達(dá)的變化。 5.Western印跡法：檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Panc-1細(xì)胞HPSE蛋白表達(dá)的變化。 6.MTT法：檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Panc-1細(xì)胞相對(duì)存活率。 7.Transwel

8、l侵襲室方法：檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Panc-1細(xì)胞的體外侵襲力。 結(jié)論:1.靶向AS-ODN抑制人胰腺癌細(xì)胞HPSEmRNA和蛋白的表達(dá)。 2.靶向AS-ODN抑制人胰腺癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)。 3.靶向AS-ODN降低人胰腺癌細(xì)胞的體外侵襲力。 4.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床應(yīng)用HPSEAS-ODN治療胰腺癌提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第三部分：乙酰肝素酶反義寡核苷酸對(duì)人胰腺癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響 目的:觀察乙酰肝素酶(

9、heparanase，HPSE)反義寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide，AS-ODN)對(duì)裸鼠人胰腺癌細(xì)胞皮下移植瘤生長(zhǎng)和基因表達(dá)的影響作用。 方法:1.細(xì)胞培養(yǎng)：人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1購(gòu)于北京協(xié)和醫(yī)院。 2.合成HPSEAS-ODN，序列為：5'-GGCTTCGAGCGCAGCAGCAT-3'；無(wú)義寡核苷酸(nonsenseoligodeoxynucleotide，NS-ODN)作為

10、對(duì)照。 3.建立裸鼠人胰腺癌細(xì)胞Panc-1皮下移植瘤模型：BALB/C雄性裸鼠15只，6～8周齡，體重18～22g，由湖北省防疫站動(dòng)物中心提供。每只裸鼠于背部皮下接種0.2ml細(xì)胞懸液(Panc-1細(xì)胞濃度為1×108/ml)。 4.實(shí)驗(yàn)分組：隨機(jī)分為AS-ODN治療組(皮下注射AS-ODN10mg/kg體重)，NS-ODN治療組(皮下注射NS-ODN10mg/kg體重)，對(duì)照組(皮下注射生理鹽水0.2ml/只)。隔日