棉花體細胞胚胎發(fā)生機制研究及p53基因的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、以海島棉新海20、新海24和陸地棉新陸早1號、中棉所44號的下胚軸為受體材料,誘導(dǎo)其體細胞胚胎發(fā)生建立相應(yīng)的植株再生體系,研究棉花體細胞胚胎發(fā)生過程中生理生化及細胞超微結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)胚性愈傷和農(nóng)桿菌菌液噴霧兩種途徑進行p53基因的遺傳轉(zhuǎn)化,并針對T1代轉(zhuǎn)化植株進行了PCR和Southern檢測。結(jié)果表明:這兩種方法均可獲得轉(zhuǎn)化植株;外源基因已整合入棉花基因組中。本研究得到的主要結(jié)論如下:
　　在海島棉愈傷組織誘導(dǎo)階

2、段,激素組合(0.1mg/L2,4-D+0.1mg/LKT)可有效誘導(dǎo)出愈傷組織,繼代兩次后接種于含0.1mg/LNAA+0.1mg/LKT激素的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量的不定根為分化做了良好的準(zhǔn)備。陸地棉愈傷組織誘導(dǎo)階段的最優(yōu)激素組合為0.05mg/L2,4-D+0.1mg/LKT。
　　在愈傷組織分化和體細胞胚胎發(fā)生階段,降低硝酸銨的用量,加倍硝酸鉀用量更有利于棉花愈傷組織的生長和體胚發(fā)生;在成苗培養(yǎng)基中加入0.1mg/LNA

3、A可有效提高體胚成苗率。
　　胚性愈傷組織細胞之間結(jié)合緊密、中央大液泡消失、有大量線粒體存在,細胞核位于細胞中央,有明顯的核仁結(jié)構(gòu)。非胚性愈傷組織細胞排列疏松且排列不規(guī)則,存在中央大液泡,線粒體數(shù)目較少,細胞核偏向細胞的一端。
　　在整個棉花體細胞胚胎發(fā)生過程中,胚胎發(fā)生時愈傷所含可溶性糖含量最低;可溶性蛋白質(zhì)含量最高;且SOD、POD和CAT活性最強。胚性愈傷中的3種抗氧化物酶活性對細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及胚性細胞的分化有著極

4、其重要的調(diào)節(jié)作用。
　　基于胚性愈傷形成過程中線粒體數(shù)目會明顯增加的變化規(guī)律,利用MATLAB軟件針對細胞線粒體個數(shù)和與細胞的面積比兩個方面比較得出:胚性愈傷組織細胞內(nèi)線粒體與細胞面積比大于非胚性愈傷組織細胞內(nèi)線粒體與細胞面積比;胚性愈傷組織細胞內(nèi)線粒體個數(shù)明顯多于非胚性愈傷組織細胞內(nèi)線粒體個數(shù)。
　　農(nóng)桿菌介導(dǎo)棉花胚性愈傷轉(zhuǎn)化體系存在周期長、易受基因型限制、消耗人力和財力等問題,但其轉(zhuǎn)化率較高,轉(zhuǎn)基因后代多為單拷貝插入,具