miR-196a基因及基靶基因在食管癌發(fā)生和預(yù)后中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、食管癌是世界常見(jiàn)惡性腫瘤之一，每年新增病例約40萬(wàn)～50萬(wàn)例，其中大約50％左右的病例發(fā)生在中國(guó)。河北省磁縣是中國(guó)的食管癌高發(fā)區(qū)，食管癌的患病率與死亡率居全省惡性腫瘤的首位，嚴(yán)重威脅人類的健康。顯著的地域性分布差異（高、低發(fā)區(qū)發(fā)病率相差500倍）和家族聚集性現(xiàn)象是高發(fā)區(qū)食管癌的流行病學(xué)特征。提示環(huán)境因素和遺傳因素可能均在食管癌發(fā)生過(guò)程中起重要作用。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一類高度保守的、大約有23個(gè)核苷酸的、內(nèi)源

2、性非編碼小分子RNA，廣泛存在于人類及其它真核生物體內(nèi)。miRNAs可作為癌基因或抑癌基因，通過(guò)與其靶基因、上游轉(zhuǎn)錄因子及各種反饋調(diào)控回路等相互交織組成復(fù)雜的生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，為腫瘤的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。
　　研究發(fā)現(xiàn)miR-196與多種腫瘤發(fā)生及預(yù)后相關(guān)，以癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用。miR-196在食管癌中高表達(dá)，表明它作為癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。存在于miR-196a-2基因上的T/C多態(tài)(rs1161

3、4913)，能夠引起pre-miR196a2莖區(qū)G∶C到G∶T的改變，可能會(huì)影響pre-miR-196a-2變成成熟體的過(guò)程或影響該miRNA的靶點(diǎn)識(shí)別，并且具有組織特異性。同時(shí)，miR196a2作為一個(gè)內(nèi)源性miRNA基因，擁有自己的啟動(dòng)子區(qū)。存在于miR-196a-2基因啟動(dòng)子區(qū)的功能性多態(tài)rs35010275有可能影響基因的表達(dá)水平，攜帶GG基因型能夠上調(diào)胃癌患者的癌組織或者癌旁正常組織的miR-196a-2的表達(dá)水平。
　

4、　miR-196a的候選靶基因包括HOX家族，HMGA2，ANXA1和p27kip1等。研究發(fā)現(xiàn)，miR-196可通過(guò)抑制HOXB8的蛋白表達(dá)，促進(jìn)HL60細(xì)胞向髓細(xì)胞分化;通過(guò)下調(diào)p27kip1的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞的增殖;另外，細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn), miR-196a表達(dá)水平增高能夠?qū)е翧NXA1表達(dá)下調(diào)，而ANXA1表達(dá)的抑制或缺失與食管癌的發(fā)生有關(guān)。
　　本研究首先應(yīng)用PCR-LDR技術(shù)檢測(cè)并探討miR-196a-2基因

5、rs11614913 T/C多態(tài)、rs35010275 G/C多態(tài)與中國(guó)食管癌高發(fā)區(qū)磁縣人群食管癌發(fā)生和預(yù)后的關(guān)系;其次，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了miR-196a基因及其靶基因ANXA1、p27kip1、HOXC8和HOXB8在食管癌組織、癌旁組織和正常黏膜組織中的表達(dá)情況。深入分析了miR-196a基因及其靶基因表達(dá)水平之間的關(guān)系。再次，進(jìn)行miR-196a基因的過(guò)表達(dá)或抑制，并通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)研究

6、miR-196a對(duì)食管癌細(xì)胞株Eca109細(xì)胞和KYSE30細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。
　　第一部分 miR-196a-2基因多態(tài)性與ESCC遺傳易感性及預(yù)后的關(guān)聯(lián)研究
　　目的:
　　探討miR-196a-2基因rs11614913 C/T SNP和rs35010275 C/GSNP與食管癌高發(fā)區(qū)磁縣人群ESCC遺傳易感性及預(yù)后的關(guān)系，以尋找高發(fā)區(qū)人群ESCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的分子標(biāo)志物。
　　方法:
　　本研

7、究共包括597例食管癌患者和597名健康對(duì)照個(gè)體。食管癌患者是2006年～2012年在磁縣經(jīng)內(nèi)鏡普查、并經(jīng)當(dāng)?shù)蒯t(yī)院組織學(xué)檢查確診為食管鱗狀細(xì)胞癌的門診或住院病人。健康對(duì)照為同時(shí)間、同地區(qū)內(nèi)鏡普查無(wú)上消化道腫瘤的正常無(wú)關(guān)個(gè)體。
　　結(jié)果:
　　1、ESCC患者組UGIC家族史陽(yáng)性個(gè)體比例為47.6％，顯著高于健康對(duì)照組(38.4％)(x2=10.34，P＜0.01)，表明UGIC家族史可顯著增加ESCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，經(jīng)性別、年齡

8、校正后的OR值為1.46(95％CI=1.16～1.84)。
　　2、在健康對(duì)照組中miR-196a-2基因rs11614913 C/T SNP基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（x2=0.001，P=0.97）。ESCC患者組的CC、CT、TT基因型頻率分別為21.5％、51.4％、27.1％，與健康對(duì)照組的基因型頻率(24.3％、49.9％、25.8％)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=1.40，P=0.50)。與CC

9、基因型相比，攜帶CT、TT、CT/TT基因型均未增加ESCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，校正后的OR值分別為1.17(95％CI=0.88～1.56)、1.20(95％CI=0.8621.66)和1.18(95％CI=0.9021.55)。
　　結(jié)論:
　　1、miR196a2基因rs11614913 C/TSNP的T等位基因能夠增加≤60歲年齡組人群ESCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
　　2、miR196a2基因啟動(dòng)子區(qū)的rs35010275多態(tài)

10、的C等位基因是≤60歲年齡組人群ESCC的發(fā)病的保護(hù)因素。
　　第二部分 miR-196a及其靶基因在食管癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性分析
　　目的:
　　通過(guò)檢測(cè)miR-196a基因及ANXA1、p27kip1、HOXC8和HOXB8等靶基因在食管癌組織、癌旁組織和正常黏膜組織中的表達(dá)情況，以及分析miR-196a與候選靶基因之間的相關(guān)性，探討miR-196a基因及其靶基因在食管癌發(fā)生過(guò)程可能發(fā)揮的作用。
　　方法:

11、
　　收集河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科2012年9月至2013年3月食管癌根治性手術(shù)切除標(biāo)本28例。采用qRT-pCR技術(shù)檢測(cè)miR-196a基因及其靶基因ANXA1、p27kip1、HOXC8和HOXB8在食管癌組織、癌旁組織和正常黏膜組織中的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、miR-196a在癌旁組織和癌組織中的表達(dá)上調(diào)率分別是64.29％(18/28)和100％(28/28)。miR-196a在正常黏膜組織、癌旁組織和癌

12、組織中的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=42.07，P＜0.001)。
　　2、靶基因ANXA1，p27kip1和HOXB8的表達(dá)水平在正常黏膜組織、癌旁組織和癌組織中的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p值均＜0.001）。
　　結(jié)論:
　　1、miR-196a在食管癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織和正常黏膜組織;候選靶基因HOXB8、p27kip1和ANXA1的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織和正常黏膜組織;HOXC8的表達(dá)水平

13、與ESCC的發(fā)生無(wú)關(guān)。
　　2、miR-196a的表達(dá)水平與候選靶基因HOXC8、HOXB8、p27kip1和ANXA1的表達(dá)水平之間存在顯著負(fù)相關(guān)，表明miR-196a可能通過(guò)抑制靶基因ANXA1、HOXB8和p27kip1的表達(dá)而發(fā)揮癌基因的作用。
　　第三部分 miR-196a對(duì)食管癌細(xì)胞生物學(xué)行為及靶基因表達(dá)水平的影響
　　目的:
　　探討miR-196a在食管癌中的功能及其發(fā)揮功能的機(jī)制。
　　方

14、法:
　　轉(zhuǎn)染miR-196a mimic或miR-196a inhibitor及negative control，通過(guò)qRT-PCR的方法檢測(cè)miR-196a及其靶基因ANXA1、p27kip1、HOXC8和HOXB8的表達(dá)水平，對(duì)組織學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證;并通過(guò)MMT實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)研究miR-196a對(duì)食管癌細(xì)胞株Eca109和KYSE30增殖、遷移和侵襲的影響。
　　結(jié)果:
　　1、人食管

15、癌細(xì)胞株Eca109轉(zhuǎn)染miR-196a mimic或inhibitor后，miR-196a mimic轉(zhuǎn)染組中miR-196a的表達(dá)水平較陰性對(duì)照組顯著增高（約14.45倍，P＜0.01）;miR-196a inhibitor轉(zhuǎn)染組中miR-196a的表達(dá)水平較陰性對(duì)照組顯著降低（降低約29％，P＜0.01）。靶基因ANXA1、p27kip1、HOXC8和HOXB8的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2、人食管癌細(xì)胞

16、株KYSE30轉(zhuǎn)染miR-196a mimic或inhibitor后，miR-196a mimic轉(zhuǎn)染組中miR-196a的表達(dá)水平較陰性對(duì)照組顯著增高（約55.48倍，P＜0.01），靶基因HOXB8的表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;miR-196a inhibitor轉(zhuǎn)染組中miR-196a的表達(dá)水平較陰性對(duì)照組顯著降低(降低約31％，P=0.04)，HOXB8的表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:

17、
　　1、人食管癌細(xì)胞株Eca109轉(zhuǎn)染miR-196a mimic后，miR-196a的表達(dá)上調(diào);轉(zhuǎn)染miR-196a inhibitor后，miR-196a的表達(dá)下調(diào);未見(jiàn)其靶基因ANXA1、p27kip1、HOXC8和HOXB8的異常表達(dá)。
　　2、人食管癌細(xì)胞株KYSE30轉(zhuǎn)染miR-196a mimic后，miR-196a的表達(dá)水平顯著升高，其靶基因HOXB8的表達(dá)下降;轉(zhuǎn)染miR-196ainhibitor后，m