MALAT1在食管癌發(fā)生中的作用與機(jī)制研究及其與食管癌易感性的關(guān)聯(lián)分析.pdf

1、食管癌是一種高致死性的惡性腫瘤，我國西南地區(qū)是食管癌的高發(fā)地區(qū)之一，其中以鱗狀細(xì)胞癌分布最廣，大約占患者總數(shù)的90％以上，預(yù)后極差。每年因食管癌死亡人數(shù)眾多，降低食管癌死亡率的一大原則在于早期診斷及治療，其重點(diǎn)在于發(fā)現(xiàn)食管癌的易感人群及進(jìn)行早期干預(yù)。
　　食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)受到環(huán)境因素和遺傳因素的共同作用，目前的研究表明，某些特殊飲食及生活習(xí)慣的人群更易于罹患食管癌，例如喜食腌制食品、喜熱飲熱食、長期飲酒及大量吸煙者。近年來，隨著人

2、們對基因組學(xué)的認(rèn)識(shí)不斷深入，遺傳因素在食管癌發(fā)病機(jī)制中的地位逐漸被認(rèn)識(shí)。人們發(fā)現(xiàn)，攜帶某些特定基因變異的人群，忠腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)性更高，這些變異往往出現(xiàn)在與物質(zhì)代謝及腫瘤惡性行為相關(guān)的基因位點(diǎn)。與腫瘤易感性相關(guān)的遺傳變異包括寡核苷酸多態(tài)性及基因組拷貝數(shù)變異。人們對于前者的認(rèn)識(shí)已較為充分，而對后者的關(guān)注則相對較晚。由于拷貝數(shù)變異的研究方法所限，人們對于拷貝數(shù)變異與腫瘤易感性之間關(guān)系的認(rèn)識(shí)還極為局限，對于其與食管癌的易感風(fēng)險(xiǎn)之間的認(rèn)識(shí)更是知之甚少

3、。此外，前期的研究主要集中于具有蛋白編碼功能的基因序列的拷貝數(shù)變異，近年來的研究已經(jīng)表明，非編碼RNA在腫瘤的發(fā)生中扮演著同樣重要的角色，出現(xiàn)于非編碼RNA位點(diǎn)的寡核苷酸的多態(tài)性同樣可以改變?nèi)巳夯寄[瘤的風(fēng)險(xiǎn)，在本研究中，我們將對一些與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的mRNA及非編碼RNA基因位點(diǎn)的拷貝數(shù)變異是否與腫瘤易感風(fēng)向相關(guān)做出探討。這些位點(diǎn)均取自于食管癌組織中的高頻變異區(qū)，如3q26，8q24及11q13。
　　長鏈非編碼RNA是近

4、年來腫瘤學(xué)研究的一大熱點(diǎn)，既往人們認(rèn)為，基因組中大量不具備蛋白編碼功能的RNA序列在生命活動(dòng)過程中并沒有任何意義，是進(jìn)化過程中的垃圾序列。然而，近年來的研究越來越多的顯示，這些不具備編碼功能的RNA，在生命活動(dòng)過程中同樣扮演著極為重要的角色。長鏈非編碼RNA是其中極為重要的一類非編碼RNA分子。長鏈非編碼RNA在腫瘤發(fā)生過程中的作用尤為引人關(guān)注，在目前幾乎所有的人類惡性腫瘤中，均發(fā)現(xiàn)了長鏈非編碼RNA參與其中。目前已知的較為經(jīng)典的腫瘤相

5、關(guān)長鏈非編碼RNA包括H19、HOTAIR、GAS5、MEG3、MALAT1等，既往的研究表明，這些長鏈非編碼RNA與多種腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展密切相關(guān)，如肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等。
　　lncRNA MALAT1是一種經(jīng)典的腫瘤相關(guān)非編碼RNA，其促癌作用已得到廣泛認(rèn)可，但其在食管癌中的作用尚不明確。此外，MALAT1在不同組織中作用方式有別，其在食管癌中的作用與機(jī)制有待深入闡明。因此，本研究擬對MALAT1在食管癌中的功能

6、做出初步的評估，在此基礎(chǔ)上，深入探討MALAT1在食管癌中的具體作用方式，全面、深入地解釋其在食管癌發(fā)生中的機(jī)制，為我們認(rèn)識(shí)食管癌的發(fā)病及尋找治療策略提供新的證據(jù)。
　　在認(rèn)識(shí)MALAT1在食管癌發(fā)生過程中的作用與機(jī)制基礎(chǔ)上，本研究還試圖尋找調(diào)控MALAT1表達(dá)的表觀遺傳因素。前期的研究揭示了組蛋白修飾在MALAT1表達(dá)水平調(diào)控中發(fā)揮重要的作用，在本研究中，我們試圖探討表觀遺傳的另一類機(jī)制——啟動(dòng)子區(qū)的CpG島甲基化能否對MALA

7、T1的表達(dá)起調(diào)控作用。
　　我們的研究結(jié)果顯示:1、所挑取的MALAT1、PRKCI等四個(gè)腫瘤相關(guān)位點(diǎn)的拷貝數(shù)變異與食管癌的易感性均無明顯關(guān)聯(lián);2、MALAT1在食管癌組織中呈明顯的拷貝數(shù)擴(kuò)增，且擴(kuò)增與其在食管癌組織中的過表達(dá)相關(guān);MALAT1主要在晚期食管癌組織中呈現(xiàn)過表達(dá)趨勢，在早期食管癌中過表達(dá)不明顯。表明MALAT1主要促進(jìn)食管癌的深層進(jìn)展而不是其腫瘤發(fā)生;3、MALAT1的表達(dá)干擾抑制了食管癌的增殖，轉(zhuǎn)移功能，并導(dǎo)致了G

8、2/M期阻滯，以及凋亡比例增加;我們的研究結(jié)果還顯示，MALAT1的干擾可通過磷酸化激活A(yù)TM-CHK2通路，該通路的激活與G2/M阻滯有關(guān);在腫瘤組織中，MALAT1的表達(dá)水平與ATM-CHK2通路的磷酸化水平呈負(fù)關(guān)聯(lián)，說明MALAT1的過表達(dá)可能通過對ATM-CHK2通路去磷酸化修飾，抑制ATM-CHK2通路的激活，使其對DNA損傷的敏感性降低，解除DNA損傷引起的周期阻滯，從而促進(jìn)食管癌的快速生長;4、CpG島甲基化水平對MALA

9、T1的表達(dá)水平并無明顯影響。
　　本文的主要研究內(nèi)容如下:
　　1、MALAT1、PRKCI等腫瘤相關(guān)基因的拷貝數(shù)變異與食管癌易感性的關(guān)聯(lián)分析
　　我們首先對食管癌組織中常見的染色體變異區(qū)進(jìn)行了文獻(xiàn)回顧分析，發(fā)現(xiàn)3q26，8q24，11q13等區(qū)域在食管癌組織中的擴(kuò)增趨勢十分明顯，基于生殖系（血液標(biāo)本）與實(shí)體細(xì)胞（組織細(xì)胞）中遺傳變異可能存在關(guān)聯(lián)這一假說，我們將候選CNV確定在這幾個(gè)區(qū)域之內(nèi)。聯(lián)合生物信息學(xué)及雙熒光素酶

10、報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)對候選位點(diǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)性的評價(jià)，最終確定了位于腫瘤相關(guān)基因PRKCI基因座的Variation_59109，長鏈非編碼RNAMALAT1基因座的Variation_65973等共計(jì)四個(gè)CNV位點(diǎn)作為研究靶點(diǎn)。我們利用一種新開發(fā)的CNV分型技術(shù)—Accucopy方法對所挑取的CNV位點(diǎn)在生殖系細(xì)胞（血液標(biāo)本）中進(jìn)行了拷貝數(shù)分型，研究對象包括201個(gè)食管鱗癌患者及193個(gè)健康對照。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，血液標(biāo)本中這四個(gè)位點(diǎn)的拷貝數(shù)變異與

11、食管癌的易感性之間并無明顯關(guān)聯(lián)。
　　2、lncRNA MALAT1在食管癌組織中的拷貝數(shù)擴(kuò)增促進(jìn)其過表達(dá)，且其表達(dá)水平與食管癌的臨床病理特征相關(guān)聯(lián)
　　利用Accucopy技術(shù)，我們對食管癌組織中MALAT1的拷貝數(shù)也進(jìn)行了檢測，在54例食管癌組織中，我們發(fā)現(xiàn)了其中12例組織中出現(xiàn)MALAT1基因的拷貝數(shù)擴(kuò)增。采用qRT-PCR的方法，我們定量檢測了MALAT1在這54對食管癌組織及對應(yīng)的正常食管組織中的表達(dá)水平，以及在食

12、管癌細(xì)胞株及正常食管上皮細(xì)胞株中的表達(dá)水平，并對MALAT1的表達(dá)水平與腫瘤大小、有無轉(zhuǎn)移等臨床病理特征進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，初步推測MALAT1在食管癌發(fā)生過程中所起的作用。結(jié)果顯示，MALAT1在食管癌組織中的拷貝數(shù)擴(kuò)增與其在食管癌中的過表達(dá)相關(guān)聯(lián)，且MALAT1的過表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　3、細(xì)胞水平研究表明MALAT1的過表達(dá)促進(jìn)食管癌的生長、遷移與侵襲，其促生長作用與其對ATM-CHK2通路的調(diào)控有關(guān)
　　通

13、過siRNA干擾技術(shù)沉默MALAT1在食管癌細(xì)胞株EC109、EC9706、KYSE150及KYSE450中的表達(dá)水平，并通過CCK8法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、裸鼠原位成瘤實(shí)驗(yàn)、transwell細(xì)胞遷移侵襲實(shí)驗(yàn)檢測MALAT1表達(dá)干擾后對食管癌細(xì)胞株的生長、克隆形成、遷移、侵襲等腫瘤細(xì)胞學(xué)行為的影響。通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測MALAT1干擾對食管癌細(xì)胞株的細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的影響，推測其調(diào)控食管癌細(xì)胞生長的機(jī)制。本部分結(jié)果顯示，對MALAT1

14、進(jìn)行表達(dá)干擾后，食管癌細(xì)胞株的生長、遷移、侵襲行為受到抑制，且食管癌細(xì)胞株的G2/M期細(xì)胞比例增加，凋亡細(xì)胞比例也增加。
　　前期報(bào)道表明了MALAT1在細(xì)胞周期及基因組穩(wěn)定性維持中的作用，基因組的穩(wěn)定性與細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)，因此，我們推測MALAT1可能參與到DNA損傷應(yīng)答通路的調(diào)控。我們利用western-blotting法檢測了MALAT1干擾前后，ATM-CHK2通路的表達(dá)水平及磷酸化水平的改變，該通路的磷酸化激活與細(xì)胞周期

15、組織相關(guān)。結(jié)果顯示，MALAT1表達(dá)干擾后，ATM-CHK2通路的磷酸化水平顯著增高，提示MALAT1的過表達(dá)與ATM-CHK2的去磷酸化失活相關(guān)，MALAT1可通過對ATM-CHK2通路的調(diào)控促進(jìn)食管癌生長。
　　4、MALAT1的表達(dá)水平不受CpG島甲基化的調(diào)控
　　既往的研究表明MALAT1的表達(dá)水平受到組蛋白甲基化、miRNA及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，表觀遺傳學(xué)機(jī)制在MALAT1的表達(dá)調(diào)控中的意義尚未得到充分揭示。在本研究中