miR-183和miR-218參與調(diào)控食管癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：
　　本研究在miRNA芯片高通量篩選結(jié)合生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上遴選食管癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的候選miRNA，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，利用熒光定量RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證并建立食管癌miRNA差異表達(dá)譜。在差異表達(dá)的miRNAs中選取反復(fù)驗(yàn)證的miR-183和miR-218進(jìn)行后續(xù)的功能研究，探索miR-183和miR-218在食管癌細(xì)胞中的生物學(xué)作用，通過識別和驗(yàn)證其下游靶基因，初步探討miR-183和miR-218影響食管癌細(xì)胞生

2、長、增殖、凋亡等生物學(xué)行為的分子機(jī)制。同時針對m iR-218在食管癌中的異常表達(dá)，進(jìn)行初步的機(jī)制研究，為闡明食管癌的發(fā)病機(jī)理、發(fā)現(xiàn)候選生物標(biāo)志提供線索。
　　方法：
　　1.在針對食管癌相關(guān)環(huán)境危險因素的流行病學(xué)問卷調(diào)查的基礎(chǔ)上，招募138例未接受放化療的原發(fā)食管鱗狀細(xì)胞癌患者，收集其癌組織及癌旁組織。送檢3對食管鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織和配對癌旁組織，應(yīng)用Agilent miRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選差異表達(dá)的miRNA。

3、r>　　2.利用miR-183 mimic和inhibitor分別轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞EC9706構(gòu)建miR-183過表達(dá)及表達(dá)缺失的細(xì)胞模型，采用熒光定量RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞miR-183的表達(dá)情況，確定轉(zhuǎn)染效率。在此基礎(chǔ)上分析miR-183對食管癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，包括EdU法檢測細(xì)胞生長增殖、Annexin-Ⅴ FITC&PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布、以及Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力。

4、　　3.利用甲基化在線預(yù)測軟件分析miR-218編碼基因啟動子區(qū)潛在的CpG位點(diǎn)。根據(jù)預(yù)測目的區(qū)域的DNA序列，分別采用亞硫酸鹽測序(BSP)和巢式甲基化特異性PCR(n-MSP)檢測兩株食管癌細(xì)胞EC9706和EC109中miR-218啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)。利用去甲基化劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)分別處理食管癌細(xì)胞株EC9706和EC109，分析去甲基化處理后miR-218表達(dá)水平的恢復(fù)情況;進(jìn)一步在癌組織和

5、癌旁組織中用n-MSP分析miR-218表達(dá)水平與其甲基化狀態(tài)之間的關(guān)系。
　　4.招募食管癌患者和1∶1匹配的健康對照血漿樣本79對。應(yīng)用實(shí)時熒光RT-PCR方法分別檢測組織中差異表達(dá)的miR-183和miR-218在血漿中的表達(dá)水平。同時利用單因素logistic回歸分析miR-183和miR-218在血漿中的表達(dá)水平與食管癌發(fā)病風(fēng)險間的關(guān)系，通過ROC曲線分析評估血漿miR-183和miR-218在食管癌中的診斷價值。

6、>　　結(jié)果：
　　1.食管癌組織microRNA差異表達(dá)譜的篩選
　　利用Agilent miRNA表達(dá)譜芯片篩選出15個食管癌組織中差異表達(dá)的miRNA，其中食管癌組織中表達(dá)上調(diào)的miRNA7個，下調(diào)的miRNA8個。利用熒光定量RT-PCR在擴(kuò)大的人群組織樣本中驗(yàn)證后，確認(rèn)7個食管癌相關(guān)差異表達(dá)miRNA與芯片結(jié)果一致(miR-139-5p，miR-218，miR-338-3p，miR-21-3p，miR-574-5p，

7、miR-183，miR-601),證實(shí)了芯片數(shù)據(jù)的可靠性。其中，miR-183在食管癌組織中高表達(dá)，miR-218在食管癌組織中低表達(dá)。通過單因素logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)其中miR-139-5p和miR-338-3p的低表達(dá)，以及miR-21-3p、miR-574-5p、miR-183和miR-601的高表達(dá)與食管癌發(fā)病風(fēng)險的增加顯著相關(guān)，進(jìn)一步利用多因素logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)miR-139-5p、miR-338-3p、miR

8、-574-5p和miR-601的異常表達(dá)增加了食管癌的發(fā)病風(fēng)險，其中結(jié)合環(huán)境危險因素分析發(fā)現(xiàn)miR-21-3p的表達(dá)水平與飲酒量相關(guān)。
　　2.miR-183調(diào)控食管癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究
　　分別應(yīng)用miR-183 mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞EC970648h后，與對照組相比，mimic轉(zhuǎn)染組miR-183的表達(dá)水平顯著升高(p＜0.001)，inhibitor轉(zhuǎn)染組miR-183的表達(dá)水平顯著降低(p＜0

9、.001），明確轉(zhuǎn)染成功后進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示。miR-183 mimic轉(zhuǎn)染組早期凋亡率明顯低于對照組(3.31±1.20 vs.7.43±1.01，p＜0.001)，晚期凋亡率亦顯著低于對照組(5.83±0.29 vs.8.77±1.59，p＜0.01)。而miR-183 inhibitor轉(zhuǎn)染組早期凋亡率高于對照組(12.39±1.89 vs.6.56±1.87，p＜0.001)，晚期凋亡率也高于對照組(

10、9.53±1.58 vs.7.36±2.42，p＜0.05)。EdU法檢測細(xì)胞增殖能力結(jié)果顯示miR-183 mimic轉(zhuǎn)染組中處于增殖期的細(xì)胞比例顯著高于對照組(p＜0.05）。細(xì)胞周期結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-183 mimic細(xì)胞與對照組相比G1期比例顯著下降(54.87±1.135vs.56.89±0.82,p＜0.05)。
　　3.miR-218調(diào)控食管癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究
　　應(yīng)用 CpG island searche

11、r(http://www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx)分析miR-218編碼基因(miR-218-1、miR-218-2)啟動子區(qū)CpG島覆蓋情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)編碼基因miR-218-1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS上游-760到-212處，編碼基因miR-218-2 TSS的-407到+117處均為CpG島富集區(qū)域。針對此區(qū)域DNA序列設(shè)計(jì)引物，采用BSP和n-MSP檢測食管癌細(xì)胞株EC109和EC9706

12、CpG島甲基化水平，發(fā)現(xiàn)miR-218-1和miR-218-2區(qū)域均呈現(xiàn)高甲基化水平。采用5-Aza-CdR去甲基化處理兩株食管癌細(xì)胞EC109、EC9706和一株人正常食管上皮Het-1A，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理后細(xì)胞miR-218的表達(dá)水平升高，而Het-1A中miR-218表達(dá)無明顯改變。利用n-MSP檢測食管組織中miR-218-1和miR-218-2的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)miR-218-1在癌組織中甲基化率(34/42)顯著高于癌旁組織(1

13、4/42)(p＜0.05)，但miR-218-2甲基化率在癌組織和癌旁組織中無顯著差異。分別將組織樣本按照miR-218-1和miR-218-2的甲基化水平將其分為甲基化組和非甲基化組，與miR-218的表達(dá)水平進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示miR-218-1甲基化組中miR-218的表達(dá)水平顯著低于非甲基化組;而對于miR-218-2而言，其甲基化與否和miR-218的表達(dá)水平無顯著相關(guān)性。熒光定量RT-PCR檢測組織樣本中miR-218、S

14、LIT2、SLIT3的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，SLIT2在癌組織中表達(dá)水平為癌旁組織的38.5％(p＜0.01)，但SLIT3在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而宿主基因SLIT2和SLIT3與miR-218的表達(dá)均顯著相關(guān)(p＜0.001)，提示miR-218與宿主基因可能共轉(zhuǎn)錄。
　　4.miR-183和miR-218在食管癌篩檢中的診斷價值研究
　　熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，與健康對照比較，食管癌患者血漿中m

15、iR-183的表達(dá)水平明顯增加(p＜0.05），而miR-218的表達(dá)顯著降低(p＜0.001）。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)血漿中miR-218的低表達(dá)與食管癌發(fā)病風(fēng)險的增加有關(guān)(OR=0.787，CI=0.685～0.903)(p＜0.001)。ROC曲線評估血漿miR-218診斷食管癌的AUC為0.651(p=0.001)。
　　結(jié)論：
　　1.本研究在食管癌組織和癌旁組織中共篩選分析得到7個差異表達(dá)的miRNA，其中

16、3個miRNA表達(dá)上調(diào)，4個miRNA表達(dá)下調(diào)。miR-183在食管癌組織中顯著高表達(dá)，miR-218在食管癌組織中顯著低表達(dá)。
　　2.增加食管癌細(xì)胞EC9706中miR-183的表達(dá)水平可誘導(dǎo)EC9706的增殖能力，抑制細(xì)胞凋亡，縮短G1期比例。miR-183通過作用于其靶基因PDCD4的3'UTR區(qū)域參與調(diào)控食管癌細(xì)胞的凋亡過程。
　　3.miR-218在食管癌中的低表達(dá)與miR-218的編碼基因miR-218-1啟動

17、子區(qū)CpG島異常高甲基化有關(guān)。增加食管癌細(xì)胞EC109中miR-218的表達(dá)可有效抑制EC109的細(xì)胞增殖能力，阻滯細(xì)胞周期于G1期。miR-218通過作用于其靶基因ROBO13'UTR區(qū)域參與調(diào)控食管癌細(xì)胞的增殖。
　　4.血漿中miR-218和miR-183的表達(dá)水平與組織中的趨勢一致，其中miR-218在食管癌患者血漿中表達(dá)顯著低于健康對照者，而miR-183在食管癌患者中表達(dá)顯著高于健康者對照。根據(jù)血漿miR-218的表達(dá)