TLR9在食管癌發(fā)生及進(jìn)展中的作用研究.pdf

1、目的：本課題以食管癌TE10細(xì)胞株和食管癌病理標(biāo)本為研究對(duì)象,觀察TLR9在食管癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)、TLR9激動(dòng)劑(Cytosine phosphate guanosine oligodinucleotide,CpG ODN),抑制劑氯喹(chloroquine,CQ)對(duì)食管癌細(xì)胞TE10增殖活性和癌細(xì)胞遷移的影響,探討TLR9的表達(dá)與食管癌臨床病理特征的相關(guān)性,為食管癌的臨床免疫治療提供新的思路和策略。
　　方法：(1)RT-

2、PCR法測(cè)定食管癌細(xì)胞TE10TLR9mRNA的表達(dá),采用Western-blot方法和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)其TLR9蛋白表達(dá)。(2)用TLR9的非特異性抑制劑CQ10μM預(yù)處理TE10細(xì)胞1h后再加10μg/mLCpGODN分別作用于TE10細(xì)胞12h、24h和48h后,MTT法檢測(cè)食管癌細(xì)胞的增殖活性。(3)運(yùn)用RT-PCR法檢測(cè)TLR9激動(dòng)劑/抑制劑對(duì)TE10細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproyeinse,

3、MMPs)MMP-2mRNA、MMP-7mRNA和環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)mRNA表達(dá)的影響。(4)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察TLR9的表達(dá)在食管癌細(xì)胞遷移中的作用。(5)采用ELISA方法檢測(cè)CpGODN對(duì)TE10細(xì)胞分泌核因子-κB(NF-κB)p65水平的影響。第二部分:收集臨床上未經(jīng)化療和放療的食管癌標(biāo)本60例,行組織分型和臨床分期,同時(shí)取癌旁組織30例(均證實(shí)無癌細(xì)胞),行常規(guī)石蠟包埋、切片,免疫組化

4、法(SP法)檢測(cè)食管癌組織和癌旁組織TLR9的表達(dá),分析TLR9的表達(dá)與食管癌臨床病理特征的相關(guān)性。
　　結(jié)果：(1)RT-PCR法檢測(cè)到食管癌細(xì)胞TE10上有TLR9mRNA的表達(dá),Western-blot方法和流式細(xì)胞術(shù)觀察到TE10細(xì)胞表達(dá)TLR9蛋白。(2)MTT法結(jié)果表明,CpGODN作用TE10細(xì)胞24h和48h均能顯著促進(jìn)TE10細(xì)胞的增殖,而經(jīng)CQ預(yù)處理的TE10細(xì)胞未見CpGODN促進(jìn)癌細(xì)胞增殖的作用。(3)RT

5、-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,CpGODN可促進(jìn)TE10細(xì)胞MMP-2mRNA、MMP-7mRNA和COX-2mRNA的活性表達(dá),且作用的同一時(shí)間段內(nèi)具有量-效關(guān)系。(4)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CpGODN可促進(jìn)TE10細(xì)胞的遷移,且具有量-效關(guān)系。(5)ELISA方法檢測(cè)到20μg/mLCpGODN作用TE10細(xì)胞的12h和24h均能促進(jìn)、提高其分泌NF-κBp65的水平。第二部分:SP法檢測(cè)食管癌組織和癌旁組織中均有TLR9的表達(dá),食管癌組織

6、TLR9蛋白表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織(P<0.05);食管癌組織中TLR9的表達(dá)與食管癌組織的分化程度、腫瘤大小、部位及TNM分期密切相關(guān)(P<0.05),而與患者的年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性(P>0.05)。
　　結(jié)論：(1)TLR9參與了食管癌的發(fā)生:在食管癌細(xì)胞和組織均高表達(dá)TLR9,且TLR9的激動(dòng)劑CpGODN顯著促進(jìn)TE10細(xì)胞的增殖。(2)TLR9的表達(dá)及其介導(dǎo)的信號(hào)通路參與了食管癌的進(jìn)展。(3)TLR9與