TLR9在食管癌發(fā)生及進展中的作用研究.pdf

1、目的：本課題以食管癌TE10細胞株和食管癌病理標本為研究對象,觀察TLR9在食管癌細胞和組織中的表達、TLR9激動劑(Cytosine phosphate guanosine oligodinucleotide,CpG ODN),抑制劑氯喹(chloroquine,CQ)對食管癌細胞TE10增殖活性和癌細胞遷移的影響,探討TLR9的表達與食管癌臨床病理特征的相關(guān)性,為食管癌的臨床免疫治療提供新的思路和策略。
　　方法：(1)RT-

2、PCR法測定食管癌細胞TE10TLR9mRNA的表達,采用Western-blot方法和流式細胞術(shù)(FCM)檢測其TLR9蛋白表達。(2)用TLR9的非特異性抑制劑CQ10μM預處理TE10細胞1h后再加10μg/mLCpGODN分別作用于TE10細胞12h、24h和48h后,MTT法檢測食管癌細胞的增殖活性。(3)運用RT-PCR法檢測TLR9激動劑/抑制劑對TE10細胞基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproyeinse,

3、MMPs)MMP-2mRNA、MMP-7mRNA和環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)mRNA表達的影響。(4)細胞劃痕實驗觀察TLR9的表達在食管癌細胞遷移中的作用。(5)采用ELISA方法檢測CpGODN對TE10細胞分泌核因子-κB(NF-κB)p65水平的影響。第二部分:收集臨床上未經(jīng)化療和放療的食管癌標本60例,行組織分型和臨床分期,同時取癌旁組織30例(均證實無癌細胞),行常規(guī)石蠟包埋、切片,免疫組化

4、法(SP法)檢測食管癌組織和癌旁組織TLR9的表達,分析TLR9的表達與食管癌臨床病理特征的相關(guān)性。
　　結(jié)果：(1)RT-PCR法檢測到食管癌細胞TE10上有TLR9mRNA的表達,Western-blot方法和流式細胞術(shù)觀察到TE10細胞表達TLR9蛋白。(2)MTT法結(jié)果表明,CpGODN作用TE10細胞24h和48h均能顯著促進TE10細胞的增殖,而經(jīng)CQ預處理的TE10細胞未見CpGODN促進癌細胞增殖的作用。(3)RT

5、-PCR檢測結(jié)果顯示,CpGODN可促進TE10細胞MMP-2mRNA、MMP-7mRNA和COX-2mRNA的活性表達,且作用的同一時間段內(nèi)具有量-效關(guān)系。(4)細胞劃痕實驗結(jié)果表明CpGODN可促進TE10細胞的遷移,且具有量-效關(guān)系。(5)ELISA方法檢測到20μg/mLCpGODN作用TE10細胞的12h和24h均能促進、提高其分泌NF-κBp65的水平。第二部分:SP法檢測食管癌組織和癌旁組織中均有TLR9的表達,食管癌組織

6、TLR9蛋白表達陽性率顯著高于癌旁組織(P<0.05);食管癌組織中TLR9的表達與食管癌組織的分化程度、腫瘤大小、部位及TNM分期密切相關(guān)(P<0.05),而與患者的年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性(P>0.05)。
　　結(jié)論：(1)TLR9參與了食管癌的發(fā)生:在食管癌細胞和組織均高表達TLR9,且TLR9的激動劑CpGODN顯著促進TE10細胞的增殖。(2)TLR9的表達及其介導的信號通路參與了食管癌的進展。(3)TLR9與