PLCε1基因在食管癌發(fā)生、進(jìn)展中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、食管癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。中國(guó)是食管癌的高發(fā)國(guó)家，食管癌在腫瘤的死亡率中排名第四。河北省磁縣是食管癌高發(fā)區(qū)，食管癌的發(fā)病率和死亡率均排名在所有腫瘤的首位，嚴(yán)重威脅著人們的健康。
　　食管癌的發(fā)生是環(huán)境因素和遺傳因素長(zhǎng)期相互作用的結(jié)果。在河北省磁縣，食管癌的發(fā)生存在家族聚集現(xiàn)象提示遺傳背景在食管癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。我們前期對(duì)候選基因的研究已經(jīng)識(shí)別了一些與磁縣人群食管癌遺傳易感性相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(single nucle

2、otidepolymorphism，SNP)。但是迄今為止，食管癌易感性的遺傳基礎(chǔ)仍不太明確。全基因組關(guān)聯(lián)研究采用高通量的基因分型技術(shù)，可以同時(shí)對(duì)成千上萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，而不需要預(yù)先選定候選基因，因此可能是沒(méi)有偏倚的研究。三個(gè)全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study，GWAS)先后報(bào)道PLCε1基因rs2274223 A/G SNP與食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cel

3、l carcinoma，ESCC）的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。隨后，這一結(jié)果在中國(guó)東部食管癌低發(fā)人群中得到證實(shí)。目前，這個(gè)SNP位點(diǎn)是否可以作為預(yù)測(cè)中國(guó)北方食管癌高發(fā)區(qū)人群ESCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志物尚未見(jiàn)報(bào)道。另外，rs11599672 T/G SNP位于PLCε1基因轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，T→G的顛換可能導(dǎo)致PLCε1基因轉(zhuǎn)錄活性和表達(dá)水平的改變。研究表明，PLCε1基因rs11599672 T/G SNP可影響非西班牙白人吸煙、飲酒相關(guān)的非口咽部頭

4、頸鱗狀細(xì)胞癌遺傳易感性。Rs11599672 T/G SNP是否影響中國(guó)北方食管癌高發(fā)區(qū)人群ESCC的遺傳易感性尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　PLCε1作為Ras原癌基因的效應(yīng)子，其在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的作用已有較為廣泛的研究。PLCε1在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮促進(jìn)或抑制作用。在化學(xué)致癌物誘導(dǎo)鼠皮膚腫瘤發(fā)生的過(guò)程中，PLCε1發(fā)揮促進(jìn)作用。隨后的研究表明，PLCε1的促進(jìn)作用可能歸因于其擴(kuò)大了炎癥反應(yīng)。PLCε1通過(guò)增加炎癥反應(yīng)和血管形成促進(jìn)鼠腸道腫瘤

5、的發(fā)生。但是，PLCε1在結(jié)直腸癌發(fā)生過(guò)程中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。另外，PLCε1在腫瘤的進(jìn)展過(guò)程中也有極其重要的作用。PLCε1被Rho激活后，刺激了IP3的產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)Ca2+的流動(dòng)、Ca2+/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞骨架蛋白細(xì)絲蛋白的磷酸化。細(xì)絲蛋白的磷酸化降低了其與細(xì)絲狀肌動(dòng)蛋白的相互作用，促進(jìn)了頭頸鱗癌細(xì)胞的遷移。RNA干擾技術(shù)沉默PLCε1基因抑制了膀胱癌細(xì)胞的侵襲能力。由此可見(jiàn)，PLCε1在腫瘤

6、的發(fā)生和進(jìn)展中均發(fā)揮重要的作用。
　　PLCε1在食管癌的發(fā)生、進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮怎樣的作用？研究表明，食管癌組織較正常食管粘膜PLCε1的陽(yáng)性表達(dá)率高;哈薩克族ESCC病人食管癌組織中PLCε1的表達(dá)水平高于其癌旁正常組織，而且PLCε1的表達(dá)增加與較晚的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。但是，PLCε1基因如何影響食管癌細(xì)胞的生物學(xué)行為及其可能的機(jī)制目前尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　因此，本研究首先探討PLCε1基因rs2274223 A/G

7、SNP、rs11599672T/G SNP與中國(guó)北方高發(fā)區(qū)人群食管癌遺傳易感性的關(guān)系，旨在尋找能夠預(yù)測(cè)食管癌高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體的遺傳標(biāo)志物，以真正實(shí)現(xiàn)食管癌的早診、早治，提高患者的生存率;為食管癌病因的遺傳學(xué)研究提供依據(jù)。
　　本研究亦擬通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默食管癌Eca109細(xì)胞PLCε1基因，觀察食管癌Eca109細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，并測(cè)定增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達(dá)水平，明確PLCε1影響Eca109細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制。研

8、究將進(jìn)一步確定PLCε1在食管癌進(jìn)展中的作用及其機(jī)制，并為食管癌的基因治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第一部分、PLCε1基因多態(tài)性與食管鱗狀細(xì)胞癌遺傳易感性的關(guān)聯(lián)研究
　　目的:探討PLCε1基因rs2274223 A/G SNP和rs11599672 T/G SNP與河北省磁縣高發(fā)區(qū)人群食管癌遺傳易感性之間的關(guān)系。
　　方法:研究包括527例ESCC患者和527名健康對(duì)照個(gè)體。采集每位研究個(gè)體的靜脈抗凝血5ml，于4℃冰箱

9、保存。食管癌患者及健康對(duì)照個(gè)體的性別、年齡、吸煙習(xí)慣及上消化道腫瘤(upper gastrointestinalcancer，UGIC)家族史的情況均在采血后由專人詢問(wèn)獲得。采血后1周內(nèi)應(yīng)用蛋白酶K消化-飽和氯化鈉鹽析法提取外周血白細(xì)胞DNA。采用聚合酶鏈反應(yīng)-連接酶檢測(cè)反應(yīng)(polymerase chain reaction-ligasedetection reaction，PCR-LDR)方法對(duì)PLCε1基因rs2274223 A/

10、G SNP和rs11599672 T/G SNP進(jìn)行基因分型，分析這兩個(gè)SNP與磁縣人群食管癌遺傳易感性之間的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.ESCC患者組UGIC家族史陽(yáng)性個(gè)體比例為48.6％，顯著高于健康對(duì)照組(39.3％)（x2=9.25，P=0.002），表明UGIC家族史可顯著增加ESCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，經(jīng)性別、年齡、吸煙狀況校正后的OR值為1.47(95％CI=1.15～1.87)。
　　2.PLCε1基因rs22

11、74223 A/G SNP基因型分布在健康對(duì)照組中符合Hardy-Weinberg平衡(x2=0.21，P=0.65)。ESCC患者組及健康對(duì)照組的AA、AG、GG基因型頻率分別為48.0％、43.9％、8.1％和57.1％、37.5％、5.4％。與AA基因型相比，攜帶AG、GG、AG/GG基因型可能增加ESCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，經(jīng)性別、年齡、吸煙狀況、UGIC家族史校正后的OR值分別為1.41(95％CI=1.09～1.83)、1.71(9

12、5％CI=1.03～2.86)、1.45(95％CI=1.13～1.85)。與攜帶AA基因型的UGIC家族史陰性個(gè)體相比，攜帶AG/GG基因型的家族史陰性個(gè)體、攜帶AG/GG基因型的家族史陽(yáng)性個(gè)體ESCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加(OR=1.41和2.10，95％CI=1.02～1.97和1.46～3.01)。
　　3.PLCε1基因rs11599672 T/G SNP基因型分布在健康對(duì)照組中符合Hardy-Weinberg平衡(x2=0.46

13、，P=0.50)。PLCε1基因rs11599672 T/G SNP等位基因頻率和基因型頻率總體分布在ESCC患者組及健康對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。與攜帶TT基因型的UGIC家族史陰性個(gè)體相比，攜帶TT基因型的家族史陽(yáng)性個(gè)體ESCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加(OR=1.59，95％CI=1.13～2.24)。
　　4.應(yīng)用2LD軟件對(duì)PLCε1基因的rs2274223A/GSNP和rs11599672T/G SNP進(jìn)行聯(lián)合分析顯示

14、，兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)間不存在連鎖不平衡現(xiàn)象(D'=0.11)。人群中最常見(jiàn)的單體型為AT，其在健康對(duì)照組中的頻率為55.2％，其他單體型頻率分別為AG(20.7％)、GT(17.5％)、GG(6.6％)。GT單體型增加了ESCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.36，95％CI=1.08～1.71)。
　　結(jié)論:
　　1.UGIC家族史可增加河北省磁縣高發(fā)區(qū)人群ESCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，遺傳背景在食管癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。
　　2.本研究

15、首次報(bào)道了PLCε1基因rs2274223A/G SNP可以作為高發(fā)區(qū)人群ESCC遺傳易感性的標(biāo)志物。UGIC家族史陽(yáng)性個(gè)體、攜帶PLCε1基因rs2274223 A/G SNP AG、GG基因型的個(gè)體、尤其是攜帶AG/GG基因型且UGIC家族史陽(yáng)性個(gè)體罹患ESCC的風(fēng)險(xiǎn)較高，應(yīng)定期接受食管內(nèi)鏡檢查，以便真正實(shí)現(xiàn)ESCC的早期診斷、早期治療。
　　3.PLCε1基因rs11599672 T/G SNP與河北省磁縣高發(fā)區(qū)人群ESCC

16、的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。UGIC家族史與rs11599672T/G SNP聯(lián)合分析表明，UGIC家族史增加TT基因型攜帶者ESCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
　　4.與最常見(jiàn)的AT單體型相比，GT單體型增加了ESCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
　　第二部分 shRNA干擾沉默PLCε1基因?qū)κ彻馨〦ca109細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制的研究目的:探討沉默PLCε1基因?qū)κ彻馨〦ca109細(xì)胞增殖的影響及其可能的機(jī)制。
　　方法:根據(jù)shRNA設(shè)計(jì)原則，針對(duì)P

17、LCε1基因不同靶點(diǎn)構(gòu)建3個(gè)能夠編碼shRNA的質(zhì)粒表達(dá)載體(PLCε11、PLCε12、PLCε13)，用于沉默PLCε1基因;同時(shí)構(gòu)建1個(gè)通用陰性對(duì)照質(zhì)粒表達(dá)載體(HK)作為對(duì)照。采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。首先以PLCε11為例摸索轉(zhuǎn)染條件，確定轉(zhuǎn)染效率，然后篩選出干擾效果最好的質(zhì)粒表達(dá)載體(PLCε12)。RT-PCR和Western blot方法分別檢測(cè)PLCε12質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后Eca109細(xì)胞PL

18、Cε1基因mRNA和蛋白表達(dá)水平，確定PLCε12質(zhì)粒表達(dá)載體RNA干擾的時(shí)間規(guī)律。MTT方法檢測(cè)PLCε12質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染48h、72h、96h后Eca109細(xì)胞的存活率。FCM檢測(cè)PLCε12質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染24h后Eca109細(xì)胞的細(xì)胞周期分布情況。RT-PCR方法檢測(cè)Eca109細(xì)胞p16、CyclinD1的mRNA表達(dá)。分析沉默PLCε1基因?qū)κ彻馨〦ca109細(xì)胞增殖的影響及其可能的機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.

19、質(zhì)粒表達(dá)載體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體按照2μg∶6μl比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高，平均為72.6％。PLCε12質(zhì)粒表達(dá)載體對(duì)PLCε1基因的干擾效果最好。PLCε12質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞后，PLCε1 mRNA表達(dá)水平于轉(zhuǎn)染后24h開(kāi)始下降，48h表達(dá)水平明顯降低，72h恢復(fù)至轉(zhuǎn)染前水平。PLCε1蛋白表達(dá)水平的變化與mRNA的表達(dá)變化規(guī)律一致。
　　2.MTT結(jié)果顯示:HK、PLCε12質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞后4

20、8h、72h，PLCε12組Eca109細(xì)胞的存活率分別為80.73％和75.88％，顯著低于HK組Eca109細(xì)胞的存活率，兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);轉(zhuǎn)染后96h，HK組與PLCε12組Eca109細(xì)胞的存活率無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　3.Eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24h，Eca109組、HK組、PLCε12組處于S期的Eca109細(xì)胞分別占19.53％、17.20％和4.80％。Eca109組和HK組處于S期的

21、Eca109細(xì)胞比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);PLCε12組處于S期的Eca109細(xì)胞比例明顯低于HK組(P＜0.05)，細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。
　　4.PLCε12質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞48h后，HK組與PLCε12組Eca109細(xì)胞p16的相對(duì)光密度值分別為0.38和0.58，PLCε12組Eca109細(xì)胞p16 mRNA表達(dá)水平明顯高于HK組Eca109細(xì)胞(P＜0.05);HK組與PLCε12組Eca1

22、09細(xì)胞CyclinD1 mRNA表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:沉默PLCε1基因?qū)ca109細(xì)胞增殖具有抑制作用，細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。其可能的機(jī)制為:沉默PLCε1基因上調(diào)了p16基因的表達(dá)，p16蛋白抑制了CDK4的活性，抑制與CyclinD1結(jié)合的Rb的Ser和Tyr殘基磷酸化，抑制轉(zhuǎn)錄因子E2F的釋放，E2F依賴性基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)受抑，阻止細(xì)胞從G1期向S期的過(guò)渡，因而抑制了Eca109細(xì)胞的增殖

23、活性。
　　第三部分、shRNA干擾沉默PLCε1基因?qū)κ彻馨〦ca109細(xì)胞凋亡、侵襲的影響及其機(jī)制的研究
　　目的:探討沉默PLCε1基因?qū)κ彻馨〦ca109細(xì)胞凋亡、侵襲的影響及其可能的機(jī)制。
　　方法:FCM檢測(cè)PLCε12質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染48h后Eca109細(xì)胞的凋亡情況。Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PLCε12質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染48h后Eca109細(xì)胞的侵襲能力。RT-PCR方法檢測(cè)Eca109細(xì)胞Fa

24、s、FasL、CD44、MMP9、VEGF的mRNA表達(dá)。分析沉默PLCε1基因?qū)κ彻馨〦ca109細(xì)胞凋亡、侵襲的影響及其可能的機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.Eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48h，Eca109組、HK組和PLCε12組Eca109細(xì)胞的凋亡率分別為26.22％、22.06％和30.27％。Eca109組和HK組Eca109細(xì)胞的凋亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);但是PLCε12組Eca109細(xì)胞的凋亡率明顯高于HK

25、組Eca109細(xì)胞(P＜0.05)。
　　2.HK、PLCε12質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞后48h，HK組與PLCε12組Eca109細(xì)胞Fas的相對(duì)光密度值分別為0.43和0.53; FasL的相對(duì)光密度值分別為0.42和0.33。兩組Eca109細(xì)胞Fas、FasL的mRNA表達(dá)水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　3.Eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48h，Eca109組、HK組和PLCε12組穿過(guò)Transwell小

26、室聚碳酸酯膜的Eca109細(xì)胞數(shù)分別為85.00、82.00和62.67。Eca109組和HK組穿過(guò)Transwell小室膜的Eca109細(xì)胞數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05); PLCε12組穿過(guò)Transwell小室膜的Eca109細(xì)胞數(shù)明顯低于HK組(P＜0.05)。
　　4.HK、PLCε12質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞后48h，HK組與PLCε12組Eca109細(xì)胞MMP9的相對(duì)光密度值分別為0.60和0.53; VEG

27、F的相對(duì)光密度值分別為0.28和0.17。兩組Eca109細(xì)胞MMP9、VEGF的mRNA表達(dá)水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。HK組與PLCε12組Eca109細(xì)胞CD44的mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.PLCε1基因的沉默促進(jìn)Eca109細(xì)胞的凋亡，可能是通過(guò)上調(diào)Fas的表達(dá)、下調(diào)FasL的表達(dá)，抑制了免疫逃逸和免疫反攻，使得Eca109細(xì)胞凋亡增加。
　　2.PLCε1基因的