丹參對肝移植大鼠供肝冷保存再灌注損傷的保護及肝細胞調(diào)亡的影響.pdf

1、供肝冷保存缺血缺氧-再灌流損傷的防護對于改善移植肝質(zhì)量，提高肝移植的成功率具有重要意義。冷保存再灌注損傷是一個由多因素參與的復(fù)雜的病理過程，其中氧自由基和炎癥介質(zhì)過度生成與釋放以及肝細胞凋亡發(fā)揮著重要作用。丹參對重要器官的缺血-再灌注損傷具有保護作用，能防止細胞內(nèi)鈣超載，并具有減輕脂質(zhì)過氧化，保護細胞膜等功能。本課題建立并改進簡便實用的雙袖套法大鼠異體原位肝移植模型，應(yīng)用含有丹參的灌注液對大鼠供肝進行灌注和冷保存，行原位肝移植術(shù)(OLT

2、)，術(shù)后檢測缺血-再灌注損傷相關(guān)指標變化和肝細胞凋亡及相關(guān)凋亡調(diào)控基因表達情況，研究探討丹參對移植肝臟冷保存-再灌注損傷的防護作用及相關(guān)機制，為傳統(tǒng)中藥丹參應(yīng)用于肝移植中的供肝保護提供理論研究基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。 第一部分：雙袖套法大鼠異體原位肝移植模型的制作與改進 目的：探討建立并改進簡便實用的雙袖套法大鼠異體原位肝移植模型以便在本課題研究中進一步應(yīng)用。 方法：在Kamada及王軒方法的基礎(chǔ)上進行了改進。供、受體均

3、為SD雄性大鼠，按照動物大小、血管粗細選擇不同口徑醫(yī)用股動脈穿刺管的外殼管自制成血管套管，用硬膜外麻醉導(dǎo)管制成膽管支架管，供體取腹部十字切口，顯露游離肝臟，并行供肝側(cè)膽管插管固定，以4℃林格氏液經(jīng)腹主動脈、門靜脈低壓雙重灌注供肝，切取供肝后在相應(yīng)灌注液中低溫保存5h；行供肝修整，門靜脈及肝下下腔靜脈預(yù)置套管；受體取腹部縱切口，自制小拉鉤顯露，受體無肝期前在門靜脈分叉處兩側(cè)用縫線預(yù)置牽引線，肝上下腔靜脈采用血管膜端端“三點”標記吻合法，門

4、靜脈及肝下下腔靜脈采用袖套吻合法，用自制“小針鉤”驅(qū)除氣泡并協(xié)助套管插入，膽管吻合采用單管插管吻合，不分離周圍組織，肝臟及腸管保持原位，術(shù)后經(jīng)陰莖背靜脈補充少量肝素生理鹽水。 結(jié)果：共行SD→SD大鼠原位肝移植手術(shù)80例，其中預(yù)備手術(shù)26例，正式實驗54例。改進后正式實驗，供體手術(shù)時間平均31min，袖套準備時間平均9min，受體手術(shù)時間平均48min，無肝期平均16min；1d存活率94.4％(51/54)。受體大鼠均于術(shù)后清

5、醒，可站立并爬行，術(shù)后進食及活動等一般狀況良好。手術(shù)各步驟較簡易快捷，成功率較高。 第二部分：丹參對大鼠移植肝冷保存再灌注損傷的保護作用 目的：應(yīng)用含有丹參的灌注液對大鼠供肝進行灌注和冷保存，行原位肝移植術(shù)，術(shù)后不同時間點檢測受體移植肝組織中缺血-再灌注損傷相關(guān)指標及肝功能變化，探討丹參對移植肝臟冷保存缺血-再灌注損傷的保護作用與機制。 材料與方法： 1.動物分組與模型制備 選用SD系雄性大鼠12

6、6只，隨機分為假手術(shù)組(A組，18只)、對照組、丹參組(B組和C組，供體與受體各27對)。假手術(shù)組：只游離肝臟，不進行肝切除和肝移植，目的是進行正常對照，以排除手術(shù)因素對實驗的影響。對照組及丹參組：采用上述已改進的手術(shù)方法行SD→SD大鼠雙袖套法原位肝移植術(shù)，丹參組供肝灌洗保存液采用加丹參注射液80ml/L的林格氏液，對照組灌洗保存液不加丹參。供肝灌注切取后于4℃相應(yīng)保存液保存5h再原位植入受體。 2.標本的采集和處理

7、對照組、丹參組受體于移植肝再灌注后1h，6h，24h各時點各處死8只，假組于術(shù)后同樣時點各處死6只取材，其余受體用于排除手術(shù)死亡及觀察存活狀態(tài)和一般狀況。從下腔靜脈采集血標本4ml離心后取血清待測；取肝中葉，部分置-70℃冰箱保存待測，部分以2.5％戊二醛及10％多聚甲醛固定待用。 3.檢測指標 (1)血清學測定血標本離心后取上清，采用全自動生化分析儀測定檢丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)。 (

8、2)肝組織中MDA、SOD及TNF-α、IL-1水平檢測取各組大鼠各時點肝組織標本約1g，制成勻漿后，以相應(yīng)的檢測試劑盒分別采用硫代巴比妥酸法(TBA法)、黃嘌呤氧化酶法(XOD法)測定氧自由基(OFR)代謝相關(guān)指標丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性；采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)測定肝組織炎性細胞因子TNF-α、IL-1濃度水平。 4.統(tǒng)計分析：全部數(shù)據(jù)均由SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理。多組間比較采用

9、完全隨機單因素方差分析。數(shù)據(jù)結(jié)果采用均數(shù)±標準差(X±S)表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1.移植肝再灌注后1h，6h及24h各時點，大鼠血清ALT和AST水平對照組(B組)及丹參組(C組)均較假手術(shù)組(A組)明顯升高(P<0.01)；但C組血清ALT、AST水平在移植肝再灌注后各時點較B組各時點明顯降低(P<0.05)。 2.與A組比較，B組和C組移植肝血流再灌流后肝組織MDA含量明顯升高，SO

10、D活性顯著降低(P<0.01)；但C組各時點肝組織MDA含量較B組減低，SOD活性較B組升高，其差異均具有顯著性(P<0.05)。 3.供肝再灌注后1h，6h及24h各時點，肝組織TNF-α和IL-1濃度水平，B組及C組均較A組明顯升高(P<0.01)；但C組各時點較B組升高程度明顯減低，其差異具有顯著性(P<0.01)。 第三部分：丹參對肝移植大鼠肝細胞調(diào)亡及其調(diào)控基因表達的影響 目的：研究丹參用于供肝灌注冷保

11、存對移植肝再灌注后肝細胞凋亡情況及凋亡調(diào)控基因Bcl-2和FasL表達的影響。同時對比觀察移植肝臟組織形態(tài)學及超微結(jié)構(gòu)的改變，進一步探討丹參對移植肝臟冷保存缺血-再灌注損傷的保護作用和機制。 材料與方法： 1.材料 低溫保存的肝組織標本及10％多聚甲醛和2.5％戊二醛固定的標本。 2.標本檢測指標 (1)采用TUNEL染色法按細胞凋亡檢測試劑盒操作說明進行檢測，光鏡下觀察各組大鼠肝臟各時點組織切片

12、肝細胞凋亡情況(凋亡細胞核呈棕咖啡色，核內(nèi)有咖啡色的凋亡小體)。細胞凋亡計數(shù)：每張切片高倍光鏡(×400)下隨機選取10個視野，計算細胞總數(shù)和凋亡細胞總數(shù)，以凋亡細胞總數(shù)/細胞總數(shù)計算出凋亡細胞百分率，作為凋亡指數(shù)(AI)。 (2)采用流式細胞儀檢測凋亡調(diào)控基因Bcl-2、FasL蛋白表達，以Bcl-2-PE標記抗體、FasL-FITC標記抗體加入研磨提取的移植肝組織細胞懸液進行反應(yīng)，流式細胞儀下反應(yīng)所發(fā)熒光強度以對數(shù)放大，光散

13、射數(shù)據(jù)在計算機上用CellQuestPlot軟件分析計算出Bcl-2及FasL陽性表達率(％)。 (3)分別以光鏡及透射電鏡對比觀察各組大鼠肝臟標本組織切片的病理形態(tài)學改變。 3.統(tǒng)計分析：同上。 結(jié)果： 1.假手術(shù)組(A組)大鼠各時點肝組織中僅見極少量TUNEL法染色的凋亡細胞。對照組(B組)及丹參組(C組)供肝再灌注后染色的凋亡細胞明顯增多，6h肝細胞凋亡染色最嚴重，亦可見少量染色陽性的肝竇內(nèi)皮細胞。

14、丹參組(C組)再灌注各時點凋亡指數(shù)(AI)明顯低于對照組(B組)相應(yīng)時點AI，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 2.與假手術(shù)組(A組)比較，對照組(B組)和丹參組(C組)移植術(shù)后肝組織Bcl-2表達明顯減少，F(xiàn)asL表達明顯增加(P<0.05)，但丹參組各時點Bcl-2表達較對照組顯著增加(P<0.01)，F(xiàn)asL表達較對照組明顯減少，其差異具有顯著性(P<0.01)。 3.光鏡下與電鏡下假手術(shù)組肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，與

15、對照組相比，丹參組大鼠肝臟光鏡下肝細胞結(jié)構(gòu)紊亂、腫脹或灶性壞死程度減輕，炎性細胞浸潤減少，肝竇內(nèi)皮細胞損傷減輕；電鏡下肝細胞核皺縮，染色質(zhì)濃集及線粒體腫脹有所減輕，嵴結(jié)構(gòu)不清，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張程度改善，肝組織細胞損害程度明顯減輕。 結(jié)論： 1.改進的雙袖套法大鼠原位肝移植術(shù)可在單人直視下進行，安全確切實用，簡化了操作，提高了手術(shù)成功率。自制血管套管簡單易行；自制小拉鉤可使暴露更加充分；經(jīng)腹主動脈和門靜脈行供肝的雙重灌注使肝

16、臟灌注更均勻，更徹底；肝上下腔靜脈“三定點”縫合法吻合確切，成功率高；所有吻合均應(yīng)無張力、保持原位；自制“小針鉤”排氣效果確切迅速。肝上下腔靜脈吻合是受體手術(shù)的難點，減少術(shù)中出血和成功的袖套吻合是手術(shù)順利進行的重要條件，熟練的顯微外科手術(shù)技巧及耐心細致的手術(shù)操作是模型成功的關(guān)鍵。 2.移植肝再灌注后OFR代謝相關(guān)指標脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量明顯增加和SOD活性明顯降低，而炎性細胞因子TNF-α、IL-1水平亦明顯升高，表明移植肝

17、冷保存再灌注損傷與OFR損傷及炎癥介質(zhì)過度釋放密切相關(guān)。用丹參灌注保存供肝可明顯減輕移植肝再灌注后肝組織中MDA的增加和SOD的下降程度，并能抑制肝組織中炎性細胞因子TNF-α及IL-1生成，從而減少OFR產(chǎn)生，減低肝組織脂質(zhì)過氧化及炎癥介質(zhì)損害，改善肝功能的損害程度，減輕供肝的冷保存再灌注損傷。 3.移植肝再灌注后肝細胞凋亡程度較正常肝組織明顯增加，抗細胞凋亡基因Bcl-2表達減少及促凋亡介導(dǎo)基因FasL蛋白表達增加，肝細胞凋