siRNA沉默F(xiàn)as基因減少大鼠肝移植冷保存和缺血再灌注損傷的研究.pdf

1、第一部分：Fas siRNA的設(shè)計(jì)、合成與篩選按sirNA的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)和化學(xué)合成3個(gè)針對(duì)大鼠Fas的siRNA，對(duì)大鼠正常肝細(xì)胞(BRL細(xì)胞)傳代養(yǎng)后，轉(zhuǎn)染Fas siRNA，篩選高效抑制Fas表達(dá)的siRNA。 材料與方法：在Genebank中查找大鼠Fas mRNA序列((3enBank Accession No．NM139194)，應(yīng)用Ambion公司的設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)針對(duì)Fas mRNA的3對(duì)Fas siRNA序列：

2、 Fas siRNA1：175位點(diǎn)，正義鏈：5’GACAACAACUGCAGAA dAdC3'，反義鏈：3’dCdA GCUGUUGUUGAGAGUCUU 5'； Fas siRNA2：315位點(diǎn)，正義鏈：5’ACACGGACAGGAAACACUA dGdT 3'反義鏈：3’dTdG UGUGCCUGUCCUUUGUGAU 5'： Fas siRNA3：481位點(diǎn)，正義鏈：5'CACCUCGUGUGGACU

3、UGAA dTdG 3'．反義鏈：3'dGdT GUGGAGCACACCUGAACUU 5'。 同時(shí)合成陰性對(duì)照siRNA：正義鏈：5'UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT3'；反義鏈3'dTdT AAGAGGCUUGCACAGUGCA 5'。 化學(xué)合成方法生產(chǎn)Fas siRNAs。 取液氮保存之大鼠BRL細(xì)胞株，傳代培養(yǎng)后用于轉(zhuǎn)染。 試驗(yàn)分組：①空白對(duì)照組；②siRNA陰性對(duì)照組；③Fa

4、s siRNA 1組：④FassiRNA 2組；⑤Fas siRNA 3組。 3對(duì)Fas siRNA分別按50nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞，作為Fas siRNA組，以陰性siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為siRNA陰性對(duì)照組，非轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染前細(xì)胞培養(yǎng)基更換為Opti-MEM，在30 μl Opti-MEM中稀釋siRNA，50μlOpti-MEM中加入2μl Lipofectamine2000混合，將稀釋的siRNA

5、與稀釋的lipofectamine2000混合，室溫培養(yǎng)20min，然后將siRNA和Lipofectamine2000的混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，搖晃孔板使充分混合。孵育48h后收集細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)Fas mRNA，Western blot檢測(cè)Fas蛋白。 采用SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對(duì)Fas mRNA進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)。使用管家基因GAPDH作為內(nèi)參，每一樣本的Fas mRNA相對(duì)量除以GAPDH

6、的相對(duì)量，即標(biāo)準(zhǔn)化，然后再用標(biāo)準(zhǔn)化值比較Fas mRNA在各樣本中轉(zhuǎn)錄水平的差異。Western blot檢測(cè)各轉(zhuǎn)染細(xì)胞Fas蛋白水平，同時(shí)檢測(cè)β-actin蛋白，作為內(nèi)參較正Fas蛋白定量。 數(shù)據(jù)處理：計(jì)量資料采用均數(shù)4-標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)，進(jìn)行單因素方差分析或予以一般統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用spss10.0軟件包，α設(shè)定為0.05。 本實(shí)驗(yàn)共合成3對(duì)siRNA，轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞48h后，抽提總RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)

7、Fas mRNA。3對(duì)siRNA均發(fā)揮了不同程度的干預(yù)效應(yīng)(P<0.01)，干預(yù)效果由強(qiáng)至弱為：Fas siRNA2>Fas siRNA1>Fas siRNA3，F(xiàn)as mRNA相對(duì)表達(dá)量(Fas/GAPDH)分別低于空白對(duì)照組(69.3±7.8)﹪、(53.5±9.0)﹪和(45.0±8.9)﹪(P均<0.01)，以Fas siRNA2抑制效率最高。而陰性對(duì)照siRNA無干預(yù)作用，與空白對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

8、 Westem blot結(jié)果經(jīng)計(jì)算機(jī)灰度掃描并與內(nèi)參照(β-actin)比較分析顯示：轉(zhuǎn)染Fas siRNA后灰度比明顯減低，F(xiàn)as蛋白表達(dá)量分別低于空白對(duì)照(50±5)﹪、(75±7)﹪和(57±9)﹪(P均<0.01)，表明在蛋白水平Fas siRNA能顯著抑制Fas基因表達(dá)，蛋白表達(dá)變化與mRNA改變基本一致，F(xiàn)as siRNA2抑制效率最高。而siRNA陰性對(duì)照和空白對(duì)照相比無明顯蛋白表達(dá)改變。 第二部分：本實(shí)驗(yàn)觀察

9、冷保存大鼠肝臟隨時(shí)程延長(zhǎng)細(xì)胞凋亡及Fas基因表達(dá)在冷灌注保存肝臟組織中的變化，并探討通過水壓注射法轉(zhuǎn)染Fas siRNA對(duì)Fas基因表達(dá)進(jìn)行抑制，能否減少冷灌注保存大鼠肝臟組織中的細(xì)胞凋亡。 材料與方法： 1、試驗(yàn)對(duì)象：16周齡SD大鼠54只，體重200-250g，均為雄性。 2、水壓注射法轉(zhuǎn)染siRNA：每組大鼠18只，10﹪水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)陰莖靜脈按實(shí)驗(yàn)分組注入配制好的實(shí)驗(yàn)藥物，注射時(shí)間控制在15秒

10、左右。實(shí)驗(yàn)分組：Fas siRNA組：注入200nmol/kg的Fas-siRNA(配入10﹪體重的磷酸鹽緩沖液(PBS)內(nèi))；siRNA陰性對(duì)照組：注入200nmol/kg的陰性對(duì)照siRNA(配入10﹪體重的PBS內(nèi))?？瞻讓?duì)照組：18只；僅注射10﹪體重的PBS。 3、大鼠供肝獲取：轉(zhuǎn)染后48h，大鼠在乙醚麻醉下經(jīng)腹主動(dòng)脈進(jìn)行肝臟冷灌注取肝。 4、標(biāo)本采集：冷保存2、4、6h后每組取6只供肝，取肝中葉進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)

11、。 5、檢測(cè)內(nèi)容：組織切片HE染色檢查、Fas免疫組化檢查、TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡、電鏡檢查，提取肝組織RNA行RT-PCR檢測(cè)Fas mRNA；組織勻漿抽提蛋白Western blot檢測(cè)Fas蛋白。 6、數(shù)據(jù)處理：計(jì)量資料采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)，采用方差分析，P<0.05時(shí)有顯著性差別。 結(jié)果： 1、所有大鼠都能安全接受水壓注射法轉(zhuǎn)染Fas siRNA。 2、TUNEL法檢測(cè)冷保存

12、大鼠肝組織肝臟組織中細(xì)胞凋亡，空白對(duì)照組的凋亡指數(shù)分別為2.40±0.29﹪、2.65±0.20﹪、6.65±0.38﹪，陰性siRNA對(duì)照組分別為2.25±0.31﹪、2.82±0.10﹪、7.60±0.29﹪。在2h、4h時(shí)，同組不同保存時(shí)間肝臟組織中凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)無顯著性差異，但當(dāng)保存時(shí)間到6h時(shí)凋亡細(xì)胞增多(P<0.01)。Fas siRNA組各時(shí)點(diǎn)凋亡計(jì)數(shù)分別為2.27±0.22﹪、1.88±0.14﹪、1.97±0.15﹪，各

13、時(shí)點(diǎn)差別不明顯，2h、4h時(shí)與對(duì)照組相比無明顯差別，但6h時(shí)明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。電鏡檢測(cè)、HE染色檢查發(fā)現(xiàn)Fas siRNA組的損傷較輕，細(xì)胞凋亡少。 3、在空白對(duì)照組和siRNA陰性對(duì)照組中，RT-PCR檢測(cè)2h、4hFas mRNA表達(dá)量無明顯差別，組間差別也不明顯，此時(shí)Fas siRNA組的表達(dá)量明顯較對(duì)照組低(P<0.01)；6h兩組對(duì)照組的。Fas mRNA表達(dá)量明顯增高(P<0.01)，組間差別不明顯，

14、而Fas siRNA組的Fas mRNA表達(dá)量仍無明顯增高，與對(duì)照組問的差別更明顯(P<0.01)。 4、在空白對(duì)照組和siRNA陰性對(duì)照組中，2、4h Fas蛋白量無明顯差別，組間差別不明顯，但Fas siRNA組的Fas蛋白量明顯較對(duì)照組低(P<0.01)；6h兩組對(duì)照組的Fas蛋白水平增高，組問差別不明顯，而Fas siRNA組的Fas蛋白水平仍無明顯增高，與兩組對(duì)照組間的差別更明顯(P<0.01)。在免疫組化檢測(cè)也可見

15、到Fas蛋白被Fas siRNA明顯下調(diào)。 第三部分：本試驗(yàn)建立大鼠肝移植模型，探討針對(duì)大鼠Fas基因的siRNA，能否通過抑制Fas基因，減少肝移植缺血再灌注時(shí)的細(xì)胞凋亡，達(dá)到保護(hù)供肝的作用。 材料與方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性SD大鼠150只，體重200-250g，分為三組，每組25對(duì)雄性SD大鼠。Fas siRNA組：供體大鼠經(jīng)陰莖靜脈注入200nmol/kg的Fas-siRNA(配入10﹪體重的PBS內(nèi))。siRNA對(duì)

16、照組：供體大鼠經(jīng)陰莖靜脈注入200nmol/kg的陰性對(duì)照siRNA(配入10﹪體重的PBS內(nèi))?？瞻讓?duì)照組：供體大鼠經(jīng)陰莖靜脈僅注射10﹪體重的PBS。轉(zhuǎn)染試驗(yàn)后48h，將供體取肝進(jìn)行原位肝移植手術(shù)。 肝臟復(fù)流后1、3、6、12、24h每組處死5只受體大鼠取材，經(jīng)下腔靜脈取血2 ml，送檢AST、ALT，作為肝細(xì)胞保存再灌注損傷的指標(biāo)。 取肝中葉，其右半部分于-80℃保存?zhèn)溆?，行RT-PCR檢測(cè)Fas mRNA、W

17、estern blot檢測(cè)Fas蛋白；部分行HE染色、TUNEL染色、免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)、電鏡檢測(cè)。 數(shù)據(jù)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，使用SPSS 10.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果對(duì)照組與siRNA組肝移植再灌注后血清ALT、AST水平都逐漸升高，6h達(dá)到高峰，隨后逐漸下降。各時(shí)點(diǎn)siRNA組的血清ALT、AST水平明顯低于對(duì)照組。 TUNEL法和透視電鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡，可見在各時(shí)點(diǎn)所取的大鼠肝臟組織標(biāo)一VII—本中