GV143-EGFP-ECAD和pIRES2-EGFP-ECAD兩種質(zhì)粒在腹膜間皮細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、目的:
　　以GV143-EGFP-ECAD和pIRES2-EGFP-ECAD兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染腹膜間皮細(xì)胞，并評(píng)估轉(zhuǎn)染效率及E-caherin在腹膜間皮細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)。
　　方法:
　　(1)以E-cadherin-pcDNA3為基因模板，pIRES2-EGFP、GV143-EGFP為基因載體，分別構(gòu)建pIRES2-EGFP-ECAD和GV143-EGFP-ECAD表達(dá)載體。將目的基因E-cadherin(ECAD E

2、-鈣粘蛋白)和基因載體（pIRES2-EGFP and GV143-EGFP）進(jìn)行雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增，利用重組體抗性篩選陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和提取、酶切鑒定、測(cè)序驗(yàn)證。
　　(2)采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法用兩種基因模板分別轉(zhuǎn)染腹膜間皮細(xì)胞株（HMrSV5），質(zhì)粒轉(zhuǎn)染分組為轉(zhuǎn)染0h、24h、36h、48h、72h組。
　　(3)在熒光顯微鏡下觀察表達(dá)EGFP（增強(qiáng)型綠色熒光蛋白）的細(xì)胞數(shù)

3、，并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。
　　(4) HMrSV5細(xì)胞株轉(zhuǎn)染后提取各組細(xì)胞總RNA，采用RealTime PCR檢測(cè)各組細(xì)胞E-cadherin mRNA的表達(dá)水平。采用Western blot及間接免疫熒光檢測(cè)各組E-cadherin蛋白的表達(dá)水平，及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組E-cadherin和α-SMA的表達(dá)水平
　　結(jié)果:
　　(1)構(gòu)建的pIRES2-EGFP-ECAD、GV143-EGFP-ECAD質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序分析證實(shí)，質(zhì)粒序

4、列無(wú)突變，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后電泳鑒定，顯示pIRES2-EGFP-ECAD2條帶分別在2.6K和5.4K的位置，GV143-EGFP-ECAD電泳結(jié)果顯示酶切后2條帶分別在4.8K、2.6K左右，證明質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　(2)以表達(dá)EGFP的細(xì)胞數(shù)評(píng)估轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染GV143-EGFP-ECAD的細(xì)胞僅見(jiàn)36h、48h有少數(shù)幾個(gè)細(xì)胞表達(dá)EGFP，24h、72h均未見(jiàn)表達(dá)。轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-ECAD的細(xì)胞提示轉(zhuǎn)染后24h

5、、36h、48h、72h均可見(jiàn)EGFP表達(dá)，36h時(shí)表達(dá)EGFP的細(xì)胞最多，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率分別為:18％、58％、41％、15％。
　　(3) Real TimePCR結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染兩種ECAD質(zhì)粒后，ECAD mRNA表達(dá)較上調(diào)，24小時(shí)達(dá)到高峰，36h、48h、72h較24h呈時(shí)間依賴性下降，但仍高于0h組。Western blot結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，分別使用兩組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的腹膜間皮細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)均在24小