尿酸對腹膜間皮細(xì)胞增殖及表達(dá)炎癥因子的影響.pdf

1、估計全人類有一百多萬人遭受終末期腎臟疾病的折磨，而且這類患者正在以每年6-7％的比例增加，治療選擇包括腹膜透析、血液透析和腎臟移植。腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是慢性腎功能衰竭的重要替代治療方法之一。與HD相比，PD在開始透析的3～5年內(nèi)總體生存率方面優(yōu)于HD；患者在家自行完成；不用打針；更好的清除中分子毒素；PD能更好地延緩殘余腎功能下降；PD患者移植腎功能恢復(fù)延遲發(fā)生率低；獲得血源性病毒感染的危險性較小。

2、因此，有學(xué)者認(rèn)為PD應(yīng)占透析總?cè)藬?shù)的32％～45％為宜。目前，全球大約有15％(＞130,000人)的透析患者采用PD方式，而我國大陸PD患者僅占透析治療的10％左右。因此，PD在我國有非常廣闊的發(fā)展前景。但PD發(fā)展也存在制約因素，CAPD患者還存在腹腔局部的慢性炎癥狀態(tài)，介導(dǎo)腹膜纖維化的發(fā)生，腹膜纖維化導(dǎo)致的超濾功能喪失是維持性腹膜透析患者退出的主要原因。 臨床中我們注意到，CAPD患者存在高尿酸血癥，患者腹膜透析灌洗液中尿酸

3、水平增高，異常尿酸水平，能否影響腹膜的超濾功能呢?而有關(guān)尿酸致病的研究有很多報道，血尿酸水平與痛風(fēng)發(fā)病率呈正相關(guān)；血清尿酸水平增高是影響中重度慢性心力衰竭患者預(yù)后的一項獨立的預(yù)測指標(biāo)；尿酸可明顯促進(jìn)VSMC細(xì)胞增殖；可溶性尿酸可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)。但目前還不清楚尿酸是否參與腹膜間皮細(xì)胞的激活，從而產(chǎn)生炎癥、致纖維因表達(dá)，導(dǎo)致腹膜纖維化。鑒于上述原因，我們設(shè)想尿酸可介導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞的激活，此類研究尚未見報道。腹膜間皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子、趨化因子

4、在腹膜炎及腹膜纖維化進(jìn)展過程中起著十分重要的作用。目前尚無有效的解決辦法。過氧化物酶增殖物活化受體-γ(peroxisome proliferator activated receptor-γ，PPAR-γ)活化后具有抗炎效應(yīng)。大鼠腹膜間皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)性表達(dá)PPAR-γ受體，受脂多糖(LPS)刺激后表達(dá)上調(diào)，PPAR-γ配體可顯著抑制LPS介導(dǎo)的CD40mRNA和ICAM-1蛋白的表達(dá)，提示PPAR-γ可能通過負(fù)性調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)分泌而參與腹腔

5、局部防御。本研究擬通過建立體外培養(yǎng)的HPMC，分別不同濃度的尿酸刺激HPMC，觀察刺激后HPMC增殖、損傷；MCP-1、ILK(整合素連接激酶)、TGF-β1(轉(zhuǎn)化生長因子β1)表達(dá)變化。探討尿酸對人腹膜間皮細(xì)胞(HPMC)影響的作用及PPAR-γ受體激動劑對尿酸效應(yīng)的干預(yù)。 第一部分：尿酸對腹膜間皮細(xì)胞(HPMC)增殖、損傷的影響 目的：觀察尿酸在體外對人腹膜間皮細(xì)胞(HPMC)增殖的影響。研究尿酸對HPMC作用的時間

6、-效應(yīng)及劑量-效應(yīng)關(guān)系、尿酸對HPMC的損傷作用，探討尿酸對HPMC的作用機(jī)制。 方法：1、細(xì)胞培養(yǎng)及分組：待生長狀況良好的HPMC株60-80％細(xì)胞貼壁后，無血清培養(yǎng)基同步24h，然后根據(jù)分組給予相應(yīng)的刺激。HPMC給予不同濃度和時間尿酸刺激。2、指標(biāo)檢測：采用MTT比色法檢測200、400、600、800、1000umol/L濃度的尿酸刺激24、48、72h后HPMC增殖情況；同時采用乳酸脫氫酶測定試劑盒，檢測培養(yǎng)液中乳酸脫

7、氫酶(LDH)水平，從而確定最佳尿酸濃度。 結(jié)果：1、與刺激前比較，尿酸在200～1000umol/L作用濃度范圍內(nèi)，抑制HPMC增殖；與對照組比較，不同程度地抑制HPMC增殖，隨尿酸濃度增高、作用時間延長，其抑制增殖作用明顯(P<0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義。2、與對照組比較，不同濃度的尿酸皆使HPMC培養(yǎng)液中LDH水平增高，尿酸在600～1000umol/L作用濃度范圍內(nèi)，LDH水平增高明顯，呈劑量、時間依賴效應(yīng)，差異均有顯著性

8、(P<0.05)。 結(jié)論：尿酸能夠抑制HPMC細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)HPMC損傷，呈劑量、時間依賴效應(yīng)。 第二部分：羅格列酮對尿酸致腹膜間皮細(xì)胞(HPMC)增殖、損傷的干預(yù)作用 目的：觀察PPAR-γ激動劑羅格列酮對尿酸致腹膜間皮細(xì)胞(HPMC)增殖、損傷作用的影響。 方法：1、細(xì)胞培養(yǎng)及分組：待生長狀況良好的HPMC株60-80％細(xì)胞貼壁后，無血清培養(yǎng)基同步24h，采用15umol/L羅格列酮預(yù)處理細(xì)胞4小時后

9、，給予600umol/L尿酸不同作用時間(24、48、72h)進(jìn)行干預(yù)。2、指標(biāo)檢測：采用MTT比色法檢測HPMC增殖情況；采用乳酸脫氫酶測定試劑盒，檢測培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)水平。 結(jié)果：1、600umol/L，尿酸作用HPMC24、48、72h后，抑制HPMC增殖；與對照組比較，抑制增殖作用明顯(P<0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義；羅格列酮干預(yù)后，各不同時間點，尿酸對HPMC抑制作用減弱。2、600umol/L尿酸作用HPM

10、C24、48、72h后，HPMC培養(yǎng)液中LDH水平增高，與對照組比較，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；羅格列酮干預(yù)后，各不同時間點，HPMC培養(yǎng)液中LDH水平降低(P<0.05)。 結(jié)論：羅格列酮能夠降低尿酸對HPMC增殖抑制、損傷作用。 第三部分：羅格列酮對尿酸誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞(HPMC)表達(dá)炎癥因子的影響 目的：觀察600umol/L尿酸濃度在不同時間范圍內(nèi)(24、48、72h)誘導(dǎo)人HPMC表達(dá)炎癥因子MCP

11、-1，ILK(整合素連接激酶)，TGF-β1的作用。 方法：1、細(xì)胞培養(yǎng)及分組：待生長狀況良好的HPMC株60-80％細(xì)胞貼壁后，無血清培養(yǎng)基同步24h，將細(xì)胞分為對照組(只使用培養(yǎng)液)、尿酸組(培養(yǎng)液+600umol/L尿酸)、羅格列酮組(培養(yǎng)液+15umol/L羅格列酮)、尿酸+羅格列酮組(培養(yǎng)液+15umol/L羅格列酮+600umol/L尿酸)。干預(yù)組分別先采用15umol/L羅格列酮預(yù)處理細(xì)胞4小時，然后根據(jù)分組給予相

12、應(yīng)的刺激。2、指標(biāo)檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測HPMC上清液中MCP-1蛋白的濃度、采用Westernblot方法、熒光定量PCR技術(shù)檢測HPMC的ILK(整合素連接激酶)、TGF-β1蛋白和基因表達(dá)。 結(jié)果：1、尿酸刺激組細(xì)胞MCP-1的蛋白表達(dá)呈時間效應(yīng)性，均較空白對照組顯著提高；2、HPMC在尿酸刺激下，ILK(整合素連接激酶)、TGF-β1的基因和蛋白表達(dá)于24、48、72h均較空白對照組顯著升高，但其基