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文檔簡介
1、目的：構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒PIRES-Ag85B，通過酶切鑒定和測序鑒定后在CHO細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，并用Western-blot檢測表達(dá)結(jié)果，為開發(fā)新型的結(jié)核病疫苗和結(jié)核病血清免疫診斷試劑奠定基礎(chǔ)。
方法：根據(jù)GenBank上結(jié)核分枝桿菌Ag85B基因的CDS序列，應(yīng)用primer premier5.0設(shè)計(jì)一對引物，分別在引物5’端引入NheⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。從結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv中提取基因組DNA，應(yīng)用
2、引物，擴(kuò)增Ag85B基因片段，用PCR回收試劑盒割膠回收后純化PCR產(chǎn)物，雙酶切PCR產(chǎn)物及真核表達(dá)質(zhì)粒PIRES，經(jīng)T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用氨芐青霉素篩選陽性克隆后，再經(jīng)PCR，雙酶切和測序進(jìn)行鑒定。應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將重組質(zhì)粒PIRES-Ag85B轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，48小時(shí)后用G418進(jìn)行篩選.并用Western blot檢測Ag85B的基因表達(dá)。
結(jié)果：從結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因組DN
3、A中擴(kuò)增出978bp的Ag85B基因，并成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒PIRES-Ag85B，經(jīng)NheⅠ和EcoRⅠ雙酶切后電泳獲得61,000bp和978bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，經(jīng)測序證實(shí)獲得目的基因序列與GenBank公布的一致，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后獲得穩(wěn)定表達(dá)Ag85B的CHO細(xì)胞株，用Western blot方法在蛋白水平檢測Ag85B的基因表達(dá)。
結(jié)論：1從結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中擴(kuò)增出Ag85B基因片段并成功構(gòu)建真
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