hla—a0201與egfp融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及其在k562細(xì)胞的表達(dá)和定位

1、中 國(guó)病 理生 理 雜志 C h i n e s eJ o u r n a lo fP a t h o p h y s i o l o g y2 0 0 4 ， 2 0 ( 5 ) ： 7 0 5 — 7 1 0[ 文章編號(hào)】 1 0 0 0 — 4 7 1 8 ( 2 0 0 4 } 0 5 — 0 7 0 5 —0 6HL A—A* 0 2 0 1與 E GF P· 7 0 5 ·· 論 著 ·

2、;融 合 蛋 白表 達(dá) 載 體 的構(gòu) 建 及 其在 K 5 6 2細(xì)胞 的表達(dá) 和定位 *何 賢輝 ，徐 麗慧 ． 一 ，劉毅 r - ， 蔡 小嫦 ，曾耀英 ( 暨南 大學(xué) 組織 移植 與 免疫 教育 部重 點(diǎn)實(shí)驗(yàn) 室 ，生 物 工程研 究 所 ，第 一 附屬 醫(yī)院 皮膚科 ， 廣東 廣 州 5 1 0 6 3 2 ；鄭 州大 學(xué)第一 附 屬 醫(yī)院 皮膚科 ， 河南 鄭 州 4 5 0 0 5 2 )[ 摘 要】目的： 構(gòu)建增

3、強(qiáng)型綠色熒光蛋白( E G F P ) 與 mA— A0 2 0 1 ( A0 2 0 1 ) 融合蛋白哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載 體 ， 分 析 其在 l ( 5 6 2 細(xì)胞 中的表 達(dá)和 亞 細(xì)胞 定位 。方 法 ：以 R T —P C R方 法 克 隆 A0 20 1e D N A ， 構(gòu)建 A‘ 0 2 0 1 一E G F P融 合蛋 白表 達(dá) 載體 ， 轉(zhuǎn) 染 l ( 5 6 2 細(xì)胞 ， 以流 式細(xì) 胞 儀和激 光共 聚焦 顯微

4、 鏡分 析 融合 蛋 白的表 達(dá) 及 其亞 細(xì)胞 定 位 。結(jié) 果 ： 從兩 個(gè) H L A —A 2陽(yáng)性供 者 外周 血 細(xì)胞 中克 隆到 A0 20 le D N A編碼 區(qū)全 長(zhǎng) 序列 。通 過(guò) P C R方 法在 起 始位 點(diǎn) 前 加 入 K o z a k 序 列并 刪 除終止 密碼 ， 成 功 構(gòu)建 A0 20 1 一E G F P融合 蛋 白表 達(dá) 載 體 。 以該 質(zhì) 粒 轉(zhuǎn) 染 K 5 6 2 細(xì) 胞 ， 5h后 A0

5、 2 0 1 和 E G F P的表達(dá)百分率分別為 2 5 ． 1 2 ± 2 ． 2 6 、 2 7 ． 3 7 ± 3 ． 5 9 ， 2 4h 后表 達(dá)水平無(wú)明顯提高。表達(dá)的融合蛋白主 要 分 布于 細(xì)胞 膜上 ， 胞 內(nèi)分 布較 少 。相反 ， 轉(zhuǎn)染 空載 體 的細(xì) 胞不 表 達(dá) A0 2 0 1 分 子 ， 僅 表 達(dá) E G F P ， 且 其 在 細(xì)胞 內(nèi)呈 彌 散樣 分 布 。結(jié) 論 ： 成 功構(gòu)建

6、A0 20 1 一 E G F P 融 合 蛋 白表 達(dá)載 體 ， 并 在 l ‘ = 5 6 2 細(xì) 胞 中得 到 表 達(dá) ， 表 達(dá) 產(chǎn) 物 主要 分 布 于 細(xì)胞 膜表 面 ， 提 示表 達(dá)該融 合 蛋 白的 l ( 5 6 2 細(xì)胞 是 潛在 的人 工抗 原提 呈 細(xì)胞 。[ 關(guān)鍵詞】 H L A— A 2 抗原 ； 綠色熒光蛋 白質(zhì)類(lèi)； 融合蛋白質(zhì)類(lèi) ； 顯微鏡檢查 ， 共焦 [ 中圖分類(lèi)號(hào)】8 ； R 3 9 2 ． 1 2

7、[ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A抗 原 特 異性 T細(xì)胞 主要 通 過(guò) T細(xì) 胞受 體 ( T—c e l lr e c e p t o r ， T C R ) 識(shí) 別 抗 原 提呈 細(xì) 胞 ( a n t i g e n—p r es e n t i n gc e l l ， A r c ) 表面的抗原肽 一 主要組 織相容性復(fù) 合 體 ( p e p f i d e—m a j o rh i s t o c om p a t i b i l i

8、 t yc o m p l e xp r o t e i nc o m p l e x ， p M H C ) ] ] i ] 活化 ， 這種抗原特異性 活化作用一 般需在 非 特 異性 的共 刺 激信 號(hào)協(xié) 同作 用 下 才 能 完 成 ?。T細(xì)胞識(shí)別 的是 與 自身 M H C結(jié) 合 的抗 原肽 ，這就是 T C R識(shí)別 的 M H C限制 性l 2 J 。人類(lèi) 經(jīng)典 M H CI 類(lèi) 分子包括 m —A 、 B和 C ， 這些 I

9、 類(lèi)分 子極具 多 樣性 ， 不 同個(gè)體 的 M H C分子 組 合極 少 完 全 相 同l 3 _ 3 。因此 ， 在 研究 T細(xì)胞 識(shí) 別和活 化作 用機(jī) 理 時(shí)需要 使 用來(lái) 自 自身的 A P C和 T細(xì)胞 ， 以避免 同種 異基 因反 應(yīng) ， 因而 自身 A P C的制備及 其不 一致 性 成 為一 個(gè)限 制 因素L 4 - 6 J 。 另 一方 面 ， 不 論 何 種 種 族 ， 人 類(lèi) 約 有 5 0 ％的個(gè)體都具有 m

10、—A0 2 0 1 等位基 因 ， 是一 個(gè) 不具種 族特異性 的高頻 M H CI 類(lèi)等位基 因l 3 J 。我們 從 m A —A 2陽(yáng) 性 供 者 外 周 血 單 個(gè) 核 細(xì) 胞 ( p e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l l ，P B M C ) 克 隆 了 H L A—A0 2 0 1[ 收稿 日期 】 2 0 0 3 — 0 8 — 2 6[ 修回日期】

11、2 0 0 3 —1 l 一1 l* [ 基金項(xiàng) 目】國(guó)家 自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng) 目( N o ． 3 0 2 3 0 3 5 0 ) ：國(guó)家 重點(diǎn) 基礎(chǔ)研 究 發(fā) 展規(guī)劃 項(xiàng) 目( 9 7 3 )( G 2 0 0 0 0 5 7 0 0 6 )△通 訊 作者 T e l ： 0 2 0 — 8 5 2 2 0 7 3 2 ；E —m a i l ： o m a s @j n u ． e d u ． c nc D N A全長(zhǎng)編碼 區(qū) ，

12、 構(gòu)建 了 A0 2 0 1 一E G F P( e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ) 融合 蛋 白哺乳 動(dòng)物 細(xì)胞 表 達(dá) 載體 ， 并在 不表達(dá)人類(lèi) M I - I CI 類(lèi)分 子的 K 5 6 2細(xì)胞 中得到表 達(dá) ， 旨在 進(jìn) 一 步 建 立 一 個(gè) 較 為 通 用 的人 工 A P C系統(tǒng) ， 為定 量化 和可視 化 研究 抗原 特 異 性 T

13、細(xì) 胞識(shí)別和活化作用 機(jī)理打下基礎(chǔ) 。材 料 和 方 法 1 主要試劑 大腸肝 菌 D H 5 a由本校 周 天鴻 教授 惠 贈(zèng) ；真 核 表達(dá)載體 p E G F P—N 1 購(gòu) 自 C l o n T e c h ； 限制性 內(nèi)切 酶 R I 和 B a mH I 、 T 4D N A 連 接 酶 、 高 保 真 D ~p WmD N AT a q聚 合 酶 等均 為美 國(guó) N e wE na n dB i o l a b s產(chǎn) 品

14、 ： T R I z o l 試 劑 、 T h e r m o S c r i p tR T—P C R系統(tǒng)購(gòu) 自 I n —v i t r o g e n ； Q I A q u i c kG e lE x t r a c t i o nK i t 、Q I A p m pS p i nM i n i p r e pK i t 和 Q i a g e nP l a s m i dM i d iK it 為德 國(guó) Q I A G E

15、N公 司產(chǎn)品 ； 淋 巴細(xì)胞 分離 液為 挪威 N Y C O M E D產(chǎn) 品；a n t i —I { I A — A， B ， c—P E( p h y c oe r y t h r i n ， 藻紅蛋 白) 購(gòu) 自 美 國(guó) e B i o s c i e n c e 公 司； 碘 化丙 錠 ( p r o p i d i u mi o d i d e ，P I ) 購(gòu) 自 S i g m a公 司； R P M I 一 1 6

16、4 0培養(yǎng)基及胎 牛血 清 ( F B S ) 為 美 國(guó) G i b c o 產(chǎn) 品 。2 人 白細(xì)胞總 R N A抽提及 e D N A合成 取健康 成年志愿者肝素抗 凝靜脈血 3m L ， 按前 維普資訊 http://www.cqvip.com 有 質(zhì) 粒 都 已接 入 預(yù) 計(jì) 大 小 的 外 源 片 段 ， 序 列 分 析 證 實(shí)其 中 6 個(gè) 克隆 ( 圖 1 ) 包 含 的 e D N A序 列 為正 確 的 A0 2 0

17、 1 基 因編 碼 區(qū)全 長(zhǎng) 序 列 。從漢 族 人 中所 克 隆 的 H I A — A0 2 0 1e D N A序 列 已在 C , e n B a n k登記 ， 登 錄 號(hào) 為 A Y 3 6 5 4 2 6 。lO 0 o ．6 o o ．2 0 0 ．F i g1 肼 一P C R a mp l i l l e a t i o na n dc l o n i n go f} ⅡA — A 0 2 0 1e DN A f

18、r o m h u 蚴 l e u k o c y ~ ．1 ， 7 ： 2 O Ob pD N Al a d d e r ； 2 ， 3 ： l i t —P C Rp r o d u c t sf r o md o n o r1a n d2； 4， 5， 6 ： r e c o mb i n a n tp l a s mi d ／E c o RI+B a mH I ( d o n o r1 ) ； 8 ， 9 ，1 0 ：r e

19、c o m b i n a n tp l a s m i d ／ E c o R I+B a m H I ( d O n O r2 ) ．圖 1以 l i T一砌 l 方法從 人白細(xì)胞 中擴(kuò)增 I l i A—A0 2 0 1e D N A及其克隆 2A0 2 0 1 一E G】融 合蛋 白哺乳 動(dòng)物 細(xì)胞 表 達(dá)載 體構(gòu) 建 利用帶 有 K o z a k序列及 刪 除終止 密碼 的一對(duì) 引物 ， 經(jīng) P c R擴(kuò) 增 A0 2 0

20、1 基 因 編碼 區(qū) 全 長(zhǎng) 序 列 ( 圖2 ) ， 經(jīng)酶切 連接 至 p E G F P—N 1 ， 使 A0 2 0 1 的 閱讀 框 與 E G F P相 同 ， 并 連 接 于 E G F P基 因 的 5 ’ 端 ， 轉(zhuǎn) 化 D I - 1 5 c c ， 選取 3 個(gè)菌落抽提 質(zhì)粒 ， 經(jīng) 酶切鑒定所 有質(zhì)粒 都 已接人預(yù)計(jì) 大小 的外 源 片段 ( 圖 2 ) ， D N A序 列分 析證 實(shí) A0 2 0 1 基因編碼

21、 區(qū)全 長(zhǎng)( 包括信號(hào) 肽和跨膜 區(qū)編碼序列 ) 已正確 接人 p E c r r , 一N 1 ， 位 于 E C F P基 因的 5 ’ 端 ， 并與 E G F P基 因 閱讀 框相 同， 獲得 的載體 稱(chēng)為 p E G F P ／ AO 2 O 1 。1_ 0 0 0 _ -6 Uo．2 0 0 ．123456。一 F i g2Co n s t r u c t i o na n di d e n t i f ic a t i

22、o no fma mma l i a nc e l le x p r e s s i o nv e c t o rf o rA 0 2 01 一 E GF P f u s i o np r o t e i n．1 ， 3 ： 2 0 0b pD N Al a d d e r ； 2 ： P C Rp r o d u c to fA0 2 0 1 ； 4 ，5， 6：p E GF P ／ A 0 2 01p l a s mi d ／E c

23、 o RI + B a m H I ．圖 2Am l —lF PI J 合 蛋 白哺乳 動(dòng) 物 細(xì)胞 表 達(dá)載 體 的構(gòu) 建和 鑒定 · 7 0 7 ·3A0 2 0 1 一 E G F P融合蛋 白在 K 5 6 2細(xì) 胞 中表 達(dá)和 定位 K 5 6 2細(xì)胞 為成淋 巴細(xì)胞型 白血病 細(xì)胞 ， 不 表達(dá) 任何 M H CI 類(lèi) 分子 ， 利 用哺乳 動(dòng) 物 細(xì)胞 核轉(zhuǎn) 染儀 將 p E C F P ／ A0 2

24、 0 1 轉(zhuǎn) 人 K 5 6 2細(xì)胞 核后 ， 流式 細(xì)胞 儀 分 析顯示 ， 在 轉(zhuǎn) 染后 5hK 5 6 2細(xì)胞 表達(dá) E G F P ( 綠 色熒 光) 和 I l i a —A0 2 0 1 分 子 ( P E—I l i a —A， B ， C 陽(yáng)性 ) ， 轉(zhuǎn)染后 2 4h ， 表達(dá)水平雖 然有所 提 高 ， 但 無(wú) 明顯 差別 ( 表 1 和圖 3 ) 。并且 ， 綠 色熒光 陽(yáng)性 的細(xì)胞均 可 以被熒光抗 體 P E—

25、H L A —A ， B ， C染 色 ， 說(shuō) 明 A0 2 o 1一 E C F P融 合 蛋 白在 細(xì)胞 膜 表 面 表 達(dá)。 相 反 ， 轉(zhuǎn) 人 p E C F P—N 1 空載體的細(xì)胞只表達(dá) 高水 平 的 E G F P ( 綠 色熒 光 ) ， 而不能 被抗體染 色 ( 圖 3 B 、 E ) ， 說(shuō) 明不 表達(dá) M H CI 類(lèi)分子。表 1 轉(zhuǎn)染后的 K5 6 2 細(xì)胞中表達(dá) Am l 一姍 融合蛋白的百 分 率 T a b

26、1E x p r e s s i o np e r c e n t a g e sA 0 2 01 一 EG F Pf u s i ~ 嚏t 面 i nt r a n a f e c t e dK 5 6 2c e l l s( i ±s ． ， l = 3 )E G F Pp o s i t i v e ( ％)A伽 p 嵋( ％ )4 h2 4h5h2 4 hC 0 “ b 【 o l0 ． 7 6 ±0 ．

27、2 60 ． 7 6± O ． 1 20 ． 6 I ± O ． 5 40 ． 4 6± O ． 0 6一 N I5 7 ． 5 0 ~2 ． 7 5 “7 “ ／ ． 0 6 ±1 ． 9 5 ” O ． 3 4 ~ 0 ． 3 11 ． 2 0 + 0 ． 7 1p 附 P ／ ^咖 l2 7 ． 3 7 ~3 ． 5 9 ”3 9 ． 3 1 ±1 0 ． 舳 2 5 ． 1 2

28、+2 ． 2 6 ”3 6 ． 凹±8 ． 2 4’ P<0 ． 0 5 。 一 P< 0 ． 0 1循 。 咖1 0 1 ．為 了進(jìn) 一 步驗(yàn) 證 A0 2 0 1 一E G F P在 K 5 6 2細(xì)胞 表面表達(dá) ， 我們利用激光共聚焦顯微鏡 觀察 E ( ：在 細(xì)胞 內(nèi)的分布 。未轉(zhuǎn) 染 的 I ~ ~ 5 6 2細(xì) 胞不 能觀 察 到 任 何綠 色 熒光 ( 圖 4 A ) ， 經(jīng) 一N 1 空 載體 轉(zhuǎn)

29、 染 的 K 5 6 2 細(xì)胞 ， 呈現(xiàn)很強(qiáng) 的綠色熒光 ， 并 比較均勻地分 布 于整個(gè)細(xì)胞 內(nèi)( 圖 4 B ) ； 相反 ， 以 p F ~F P ／ A0 2 0 1 轉(zhuǎn)染 的 K 5 6 2 細(xì)胞 ， 在共 聚焦 顯微 鏡 的 “ 光 學(xué) 切 片” 下 ， 細(xì) 胞 的綠 色熒 光分布大多呈 現(xiàn)為如 圖 4 C的環(huán)狀 結(jié)構(gòu) ，大部分熒光分布 于質(zhì)膜上 ， 少量 分布 于胞 內(nèi)局部 ( 可 能為 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 一 高爾基體 系) 。討

30、 論 H I A—A0 2 0 1 為各種族 H I A —A位 點(diǎn)最 高頻等 位基因【 3 l ， 中國(guó)人 群 中該 等 位基 因頻 率 大約 5 0 ％左 右 ， 因 而 H L A—A0 2 0 1 與抗 原肽 的復(fù)合 物 ， 可 以被 5 0 ％人群 的 T 細(xì)胞 所識(shí) 別。為 了建立較 為通用 的人 工 A P C系統(tǒng) ， 對(duì)腫瘤 或病毒 抗原特 異性 T細(xì)胞與 肽 一 M H C 復(fù)合 物 的動(dòng)態(tài) 相 互作 用 進(jìn)行 定 量