小鼠肝癌多藥耐藥模型的建立及鹽酸千金藤堿對其逆轉作用的研究.pdf

1、目的：惡性腫瘤細胞對化療藥物產生的多藥耐藥性(multidrug resistance,MDR)是腫瘤細胞免受化療藥物攻擊的最重要的細胞預防機制,是導致化療失敗的主要原因。對于MDR產生機制和逆轉劑的研究,目前多采用多藥耐藥細胞系作體外研究或接種裸鼠體內的研究方法,從某種程度上難以模擬惡性腫瘤細胞在體內受到化療藥物的干預產生的MDR。為克服MDR需尋找有效的逆轉劑,目前研究證實多數逆轉劑如維拉帕米和環(huán)孢素A應用于體內會產生很大的毒性而限

2、制其臨床應用;因此開發(fā)高效、低毒、價廉的多藥耐藥逆轉劑刻不容緩。鹽酸千金藤堿(cepharanthine hydrochloride,CH)具有多種生物學活性,近年國外文獻表明其有逆轉腫瘤多藥耐藥的作用。本課題組應用臨床治療肝癌聯(lián)合化療FAP方案及采用細胞和分子生物學的檢測方法,建立獲得性KM小鼠腹水型肝癌(Hca/FAP)MDR體內模型且深入探討產生的分子機制;同時進一步研究CH對KM小鼠腹水型Hca/FAP模型的逆轉作用及機制,為C

3、H將用于臨床肝癌耐藥的逆轉提供科學依據。
　　方法：實驗采用臨床治療肝癌的聯(lián)合化療FAP方案(5-氟脲嘧啶+多柔比星+順鉑),按濃度梯度遞增法誘導KM小鼠肝癌Hca,建立獲得性Hca/FAP MDR模型。采用MTT法檢測Hca/FAP瘤細胞對7種化療藥物的耐藥譜及耐藥倍數;應用流式細胞術檢測Hca、Hca/FAP瘤細胞對羅丹明123(Rhodamine123,Rh123)蓄積與泵出作用;使用RT-PCR技術檢測Hca、Hca/FA

4、P瘤細胞多藥耐藥基因(mdr1)、多藥耐藥相關蛋白基因(mrp1)mRNA的表達水平及撤藥后Hca/FAP瘤細胞mdr1、mrp1 mRNA的表達考察模型穩(wěn)定性。進一步研究CH對Hca/FAP瘤細胞多藥耐藥性的逆轉作用。采用流式細胞儀檢測CH對Hca/FAP瘤細胞Rh123蓄積與泵出的影響;應用CH聯(lián)合FAP化療方案治療Hca/FAP MDR小鼠,計算生命延長率評價其療效、流式細胞術PI染色檢測對凋亡的影響、RT-PCR技術檢測mdr1

5、、mrp1 mRNA表達水平是否改變。通過上述實驗闡明Hca/FAP MDR產生機制及CH逆轉Hca/FAP MDR的作用和機制。 結果：1.MTT法檢測Hca/FAP瘤細胞耐藥譜及耐藥倍數Hca/FAP瘤細胞對誘導耐藥的FAP化療方案三種藥物即多柔比星(Adriamycin,ADR)、順鉑(Cisplatin,CDDP)、5-氟脲嘧啶(5-Flurouracil,5-Fu)耐藥倍數較高,分別為21.45、19.80、8.15倍;

6、且對柔紅霉素(Daunomycin,DNR)、依托泊苷(Etoposide,VP-16)、絲裂霉素(Mitomycin,MMC)、長春新堿(Vincristine,VCR)亦有一定程度的耐藥性,耐藥倍數分別為3.83、2.85、3.48、1.60倍;試驗藥物對Hca、Hca/FAP瘤細胞的IC50兩者相比經統(tǒng)計差異有顯著性(P<0.05)。試驗結果表明其對蒽環(huán)類抗生素、長春花堿類、鬼臼乙叉甙、MMC和鉑類抗腫瘤藥物有交叉耐藥性;表明小鼠

7、肝癌Hca具有多藥耐藥表型。2.流式細胞術檢測Hca、Hca/FAP瘤細胞對Rh123蓄積與泵出作用Rh123的蓄積試驗:Hca瘤細胞平均熒光強度(mean of fluorescence intensity,MFI)為204.3±11.2;Hca/FAP瘤細胞MFI為158.5±6.7,直方圖明顯左移,MFI值比Hca瘤細胞顯著減少,兩者間統(tǒng)計學有顯著性差異(P<0.01);Rh123的泵出試驗:Hca/FAP瘤細胞泵出率為68.2±

8、0.6％,而Hca瘤細胞泵出率為37.2±0.5％,藥物外排顯著增加,直方圖顯著左移且低平,兩者相比經統(tǒng)計有顯著性差異(P<0.01);Rh123蓄積與泵出試驗表明Hca/FAP瘤細胞多藥耐藥性產生機制之一是通過影響P-糖蛋白的功能,使細胞內藥物蓄積減少,泵出加快。3.RT-PCR檢測Hca、Hca/FAP mdr1、mrp1 mRNA的表達水平Hca/FAP瘤細胞mdr1、mrp1 mRNA電泳圖灰度比值分別為0.4192±0.046

9、8、0.7882±0.3171與Hca瘤細胞的灰度比值0.0480±0.0076、0.1953±0.0568相比,mdr1mRNA表達顯著增加,統(tǒng)計學有顯著性差異(P<0.01);且mrp1表達明顯增加,經統(tǒng)計有明顯差異(P<0.05);說明Hca/FAP多藥耐藥模型誘導成功,產生機制可能與mdr1、mrp1 mRNA過度表達有關。4.RT-PCR法考察Hca/FAP多藥耐藥模型穩(wěn)定性Hca/FAP瘤細胞0周、4周、8周的mdr1 mR

10、NA電泳圖灰度比值為0.6874±0.0427、0.5615±0.0837、0.4097±0.0841;mrp1 mRNA電泳圖灰度比值為1.1276±0.3256、0.7639±0.1612、0.1232±0.0253;統(tǒng)計學結果顯示撤藥4周Hca/FAP瘤細胞mdr1、mrp1mRNA表達與0周相比P>0.05,無統(tǒng)計學差異;而撤藥8周mdr1、mrp1mRNA表達與0周相比P<0.01,統(tǒng)計學有顯著性差異;說明撤藥4周Hca/FA

11、P瘤細胞多藥耐藥性保持較穩(wěn)定,而撤藥8周多藥耐藥性逐漸降低。5.流式細胞儀檢測CH對Hca/FAP瘤細胞Rh123蓄積與泵出的影響Rh123蓄積試驗:維拉帕米(Verapamil,VER)4μmol·L-1、CH8μmol·L-1、4μmol·L-1、2μmol·L-1于各檢測點與對照組MFI相比均能增加Hca/FAP瘤細胞對Rh123的蓄積,統(tǒng)計學有顯著性差異(P<0.01)。其中CH8μmol·L-1、4μmol·L-1與VER4μ

12、mol·L-1相比統(tǒng)計學有顯著性差異(P<0.01);結果表明CH、VER均能增加藥物在Hca/FAP瘤細胞內的蓄積,CH8μmol·L-1、4μmol·L-1作用優(yōu)于VER4μmol·L-1。Rh123泵出試驗:CH8μmol·L-1、4μmol·L-1于各檢測點與對照組MFI相比統(tǒng)計學有顯著性差異(P<0.01);而VER4μmol·L-1和CH2μmol·L-1在60min、120min時,與對照組相比經統(tǒng)計有顯著性差異(P<0.

13、01);CH8μmol·L-1與VER4μmol·L-1相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05);結果表明CH能減少Hca/FAP瘤細胞對Rh123的泵出,增加細胞內藥物濃度;其中CH8μmol·L-1與VER4μmol·L-1相比起效時間早,但作用相當;6.計算生命延長率評價CH聯(lián)合FAP化療方案對Hca/FAP MDR模型的逆轉作用VER、CH聯(lián)合FAP化療方案對Hca/FAP瘤細胞有一定的抑制作用:FAP+VER2.5mg·kg-1、CH

14、5mg·kg-1、CH2.5mg·kg-1組均可明顯延長Hca/FAP MDR小鼠的生存時間,生存天數為26.38±7.31、26.44±9.37、27.25±8.53,生命延長率達到了45.18％、45.51％、49.97％,與生理鹽水(NS)組(18.17±5.42天)相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05),三組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05);單用FAP、CH5mg·kg-1、2.5mg·kg-1組與NS組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05

15、);表明VER、CH聯(lián)合FAP化療方案可延長Hca/FAP MDR小鼠的生存時間,CH與VER的作用相當。7.RT-PCR技術檢測CH聯(lián)合FAP化療方案對Hca/FAP瘤細胞mdr1、mrp1 mRNA表達水平的影響FAP聯(lián)合VER2.5mg·kg-1、CH5mg·kg-1、2.5mg·kg-1均可明顯降低Hca/FAP瘤細胞mdr1mRNA的表達,電泳圖灰度比值分別為0.4093±0.1570、0.3733±0.2317、0.4318

16、±0.5324,與NS組(0.7835±0.3027)相比經統(tǒng)計有明顯差異(P<0.05),而三組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05);單用FAP、CH5mg·kg-1、2.5mg·kg-1組mdr1 mRNA的表達水平與NS組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05);對mrp1mRNA的表達,用藥各組與NS組相比均無統(tǒng)計學差異(P>0.05);結果說明VER、CH聯(lián)合FAP化療方案可下調mdr1 mRNA的過度表達,而對mrp1 mRNA的表達無

17、明顯影響。8.流式細胞術PI染色檢測CH聯(lián)合FAP化療方案對Hca/FAP瘤細胞凋亡的影響流式細胞術PI染色結果顯示,流式細胞直方圖上出現(xiàn)了亞G1峰,Hca/FAP瘤細胞的自然凋亡率為3.8％,FAP、CH5mg·kg-1、2.5mg·kg-1組細胞凋亡率分別為6.13±0.56％、4.65±0.90％、3.75±0.75％,與NS組(3.80±0.24％)相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05),而FAP聯(lián)合VER2.5mg·kg-1、CH5

18、mg·kg-1、2.5mg·kg-1給藥后,細胞凋亡率有不同程度的升高,分別為17.91±2.81％、20.41±1.69％、15.05±1.05％,與NS組相比經統(tǒng)計有明顯差異(P<0.05);結果表明VER、CH聯(lián)合FAP化療方案能誘導Hca/FAP瘤細胞的凋亡;
　　結論：1.采用FAP方案對Hca長期誘導致使其產生MDR,Hca/FAP瘤細胞對蒽環(huán)類、長春花堿類、鬼臼乙叉甙、MMC和鉑類抗腫瘤藥物有不同程度的交叉耐藥性。2

19、.Hca/FAP耐藥性產生機制與mdr1、mrp1 mRNA過度表達和影響P-糖蛋白的功能,使細胞內藥物蓄積減少有關。3.Hca/FAP多藥耐藥模型保持具有藥物依賴性。隨著停藥時間延長,mdr1、mrp1 mRNA表達降低,獲得性多藥耐藥性逐漸消失。4.CH能通過影響P-gp的攝入和泵出功能而增加Hca/FAP瘤細胞內藥物濃度,減少藥物的外排;且有濃度依賴性,其中CH8μmol·L-1作用優(yōu)于VER。5.CH能增強抗腫瘤藥物的作用,逆轉