鹽酸千金藤堿對(duì)人卵巢癌的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，由于早期很難發(fā)現(xiàn)，患者因出現(xiàn)臨床癥狀而就診時(shí)，往往腫瘤已對(duì)周?chē)M織器官造成侵襲，出現(xiàn)盆、腹腔內(nèi)的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移?；熓锹殉舶┑闹匾委熓侄危殉舶┑呐R床化療方案以鉑類(lèi)和紫杉醇為主導(dǎo)，化療初始時(shí)約有80％的患者顯示治療有效，然而多數(shù)患者很快就會(huì)因腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)的出現(xiàn)而使治療效果受到嚴(yán)重影響。
　　卵巢癌易于侵襲轉(zhuǎn)移和易于產(chǎn)生MDR的特點(diǎn)，使其成為臨床上預(yù)

2、后最差的婦科腫瘤，在充分治療的情況下，五年生存率仍低于45％，因此，研發(fā)、尋找更為有效的治療藥物，尤其是尋找在抑制腫瘤生長(zhǎng)的同時(shí)，還能抑制腫瘤侵襲或逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的藥物，對(duì)卵巢癌的治療具有重大意義。
　　本室參與研制的鹽酸千金藤堿(cepharanthine hydrochloride，CH)，是經(jīng)由千金藤屬植物頭花千金藤中提取的千金藤素(cepharanthine，CEP)鹽化而得到的半合成化合物。多個(gè)研究證明，CEP在某些類(lèi)型

3、的腫瘤中可以表現(xiàn)出直接的抗腫瘤活性，也可以抑制某些腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，另外有研究證實(shí)CEP可以有效地增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，而CEP或CH對(duì)卵巢癌相關(guān)方面的作用在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　為了探索CH對(duì)卵巢癌的作用，選取上皮來(lái)源的卵巢癌耐紫杉醇且具有MDR表型的A2780/Taxol細(xì)胞株和其親本的A2780細(xì)胞株為模型，采用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究了CH對(duì)卵巢癌的增殖、凋亡、遷移和多藥耐藥性的影響及其作用機(jī)制，以求擴(kuò)大CH可能的

4、臨床適應(yīng)證，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。根據(jù)涉及內(nèi)容的相關(guān)性，本研究可以分成以下兩個(gè)部分:
　　第一部分 鹽酸千金藤堿對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其機(jī)制的研究
　　目的:
　　本部分以卵巢癌A2780細(xì)胞為受試對(duì)象，旨在研究CH對(duì)A2780細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及其相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　采用MTT法檢測(cè)不同濃度的CH作用于A2780細(xì)胞72h的增殖抑制率，并求得IC50;采用M

5、TT法檢測(cè)以IC50濃度的CH作用于A2780細(xì)胞24h、48h、72h和96h的增殖抑制率;采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CH對(duì)A2780細(xì)胞凋亡的影響;采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CH對(duì)A2780細(xì)胞遷移能力的影響;采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CH對(duì)A2780細(xì)胞侵襲能力的影響;采用RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CH對(duì)A2780細(xì)胞Bcl-2、MMP-2和MMP-9mRNA表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果:
　　

6、1.CH對(duì)A2780細(xì)胞的增殖抑制，隨著濃度的增加(1.25、2.5、5、10、20、40和80μM)和作用時(shí)間的延長(zhǎng)(24、48、72和96h)，MTT結(jié)果顯示抑制率逐漸增大;CH作用于A2780細(xì)胞72h的IC50為30.21±1.24μM。
　　2.CH以不同濃度（2、4、8μM）作用于A2780細(xì)胞48h后，流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，細(xì)胞晚期凋亡呈濃度依賴(lài)性增加(8.5±1.7％、12.0±1.0％、14.3±

7、2.1％v.s.2.9±0.7％,p＜0.01)。
　　3.CH以8μM的濃度作用于A2780細(xì)胞不同時(shí)間(24、48h)后，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，細(xì)胞劃痕愈合率顯著降低（3.8±2.5％v.s.33.3±5.7％，7.1±1.8％v.s.43.5±1.2％,p＜0.01）。
　　4.CH以不同濃度（2、4、8μM）作用于A2780細(xì)胞48h后，Transwell檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，穿透基底膜進(jìn)入小室下層的細(xì)胞

8、數(shù)呈濃度依賴(lài)性減少（79.6±3.6、68.2±3.1、68.2±3.1v.s.101.4±4.9個(gè)，p＜0.01），CH對(duì)A2780細(xì)胞的侵襲抑制率呈濃度依賴(lài)性增加（21.5±3.6％、32.7±3.1％、43.0±2.6％）。
　　5.CH以不同濃度（2、4、8μM）作用于A2780細(xì)胞48h后，RT-qPCR檢測(cè)顯示，Bcl-2、MMP-2和MMP-9的mRNA表達(dá)水平均呈濃度依賴(lài)性降低。
　　小結(jié):
　　本部分

9、研究表明，CH能夠抑制卵巢癌A2780細(xì)胞的增殖，并且其抑制作用具有濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性;CH能夠濃度依賴(lài)性地促進(jìn)A2780細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡，而對(duì)早期凋亡無(wú)顯著影響，其機(jī)制可能和抑制凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因Bcl-2的表達(dá)相關(guān);CH能夠抑制A2780細(xì)胞的遷移和侵襲能力，其機(jī)制可能和抑制遷移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因MMP-2和MMP-9的表達(dá)相關(guān)。
　　第二部分 鹽酸千金藤堿對(duì)人卵巢癌細(xì)胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)及其機(jī)制的研究
　　目的:
　

10、　本部分以卵巢癌耐藥細(xì)胞A2780/Taxol和其親本的A2780細(xì)胞為受試對(duì)象，旨在研究CH對(duì)A2780/Taxol細(xì)胞MDR的逆轉(zhuǎn)作用及其相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　采用MTT法檢測(cè)不同濃度的紫杉醇作用于A2780/Taxol細(xì)胞和A2780細(xì)胞72h的增殖抑制率，求得IC50同時(shí)計(jì)算耐藥倍數(shù);采用MTT法檢測(cè)梯度濃度的紫杉醇單獨(dú)及其與CH共同作用于A2780/Taxol細(xì)胞72h的增殖抑制率，并計(jì)算IC50和逆轉(zhuǎn)倍數(shù);

11、采用羅丹明蓄積實(shí)驗(yàn)，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)并比較A2780/Taxol細(xì)胞和A2780細(xì)胞的羅丹明123（Rhodamine123，Rho-123）的蓄積能力;采用羅丹明蓄積實(shí)驗(yàn)，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CH對(duì)A2780/Taxol細(xì)胞P-gp功能的影響;采用RT-qPCR法檢測(cè)CH對(duì)A2780/Taxol細(xì)胞MDR1mRNA表達(dá)水平的影響:采用Western blot法檢測(cè)不同濃度CH對(duì)P-gp表達(dá)水平的影響;采用Western blot法檢測(cè)

12、不同濃度CH對(duì)總Akt和磷酸化Akt表達(dá)的影響，考察CH對(duì)Akt磷酸化的調(diào)節(jié)作用;采用Western Blot法檢測(cè)CH單用及與PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002合用后A2780/Taxol細(xì)胞中P-gp表達(dá)的變化，考察CH對(duì)A2780/Taxol細(xì)胞PI3K/Akt通路的影響。
　　結(jié)果:
　　1.紫杉醇對(duì)卵巢癌耐藥株A2780/Taxol細(xì)胞和敏感株A2780細(xì)胞作用72h的IC50分別為1475.0±22

13、.6和39.5±2.8ng/ml;A2780/Taxol細(xì)胞的耐藥倍數(shù)為37.3。
　　2.羅丹明蓄積實(shí)驗(yàn)顯示，A2780/Taxol細(xì)胞的Rho-123蓄積能力顯著高于A2780細(xì)胞(25.1±3.1％v.s.2.6±1.1％,p＜0.01)。
　　3.RT-qPCR實(shí)驗(yàn)顯示，A2780/Taxol細(xì)胞MDR1mRNA的表達(dá)水平顯著高于A2780細(xì)胞。
　　4.梯度濃度的紫杉醇單獨(dú)或者與不同濃度(2、4、8μM)的C

14、H共同作用于A2780細(xì)胞72h后，MTT法檢測(cè)顯示，與紫杉醇單用組相比，CH紫杉醇合用組IC50呈濃度依賴(lài)性降低(688.0±7.9、478.3±9.6、185.7±6.5v.s.1475.0±22.6ng/ml，p＜0.01)，CH的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)呈濃度依賴(lài)性增加(2.1、3.1、7.9)。
　　5.CH以不同濃度（2、4、8μM）處理A2780/Taxol細(xì)胞2h后，羅丹明蓄積實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，與未處理組相比，CH處理組Rho-123

15、的蓄積呈濃度依賴(lài)性升高(13.8±2.2％、17.5±1.0％、23.1±2.1％v.s.2.6±1.1％,p＜0.05)。
　　6.CH以不同濃度（2、4、8μM）作用于A2780/Taxol細(xì)胞48h后，RT-qPCR實(shí)驗(yàn)顯示，MDR1mRNA的表達(dá)水平呈濃度依賴(lài)性降低。
　　7.CH以不同濃度（2、4、8μM）作用于A2780/Taxol細(xì)胞48h后，Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，P-gp的表達(dá)水平呈濃度依賴(lài)性降低

16、，總Akt蛋白的表達(dá)不變，磷酸化Akt蛋白呈濃度依賴(lài)性降低。
　　8.CH與PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002共同作用后，與CH單獨(dú)作用或LY294002單獨(dú)作用相比，P-gp表達(dá)的下調(diào)顯著加強(qiáng)。
　　小結(jié):
　　本部分研究表明，CH能夠濃度依賴(lài)性地逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥株A2780/Taxol細(xì)胞的MDR，使其對(duì)紫杉醇的敏感性大大增加;CH能夠濃度依賴(lài)性地抑制A2780/Taxol細(xì)胞的P-gp功能，使其藥物轉(zhuǎn)

17、運(yùn)泵的作用大大下降;CH能夠濃度依賴(lài)性地抑制A2780/Taxol細(xì)胞MDR1mRNA的表達(dá)、P-gp的表達(dá)和磷酸化Akt的表達(dá);CH逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥的機(jī)制可能涉及對(duì)Akt磷酸化的抑制降低了PI3K/Akt信號(hào)通路的活性，從而抑制了P-gp的表達(dá)。
　　全文結(jié)論:
　　1.CH能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制可能和抑制凋亡和遷移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因Bcl-2、MMP-2和MMP-9的表達(dá)相關(guān)。
　　2.CH通過(guò)