腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑篩選方法的建立及活性分析.pdf

1、多藥耐藥(Multidrug Resistance，MDR)是目前造成腫瘤化療失敗的重要原因，尋找合適的MDR逆轉(zhuǎn)劑已成為腫瘤藥物研究的關鍵性問題。本研究建立了腫瘤細胞多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的篩選體系，然后對多種中草藥和天然產(chǎn)物進行了篩選，篩選出了兩種對不同耐藥細胞系均具有較好逆轉(zhuǎn)性的生物堿，并對逆轉(zhuǎn)機制做了初步的探索。
　　 首先，本研究建立了篩選腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的體系。本實驗選取了兩種不同的耐藥細胞系建立了三種不同耐藥蛋白的多藥耐

2、藥逆轉(zhuǎn)劑的篩選體系。P-gp蛋白是研究最早也是研究最為透徹的耐藥蛋白，在本研究中，首先在功能上確定了多藥耐藥細胞MCF-7/Adr中P-gp蛋白的外排功能，然后通過RT-PCR在細胞中檢測到了P-gp蛋白RNA水平的表達，最后通過SRB細胞毒實驗發(fā)現(xiàn)細胞毒性藥物doxorubicin的IC50值在MCF-7及其耐藥細胞系MCF-7/Adr中分別6.86±0.20μ M和40.5±1.65μ M，耐藥倍數(shù)達到了5.90倍；加入逆轉(zhuǎn)劑Ver

3、apamil處理后，MCF-7/Adr的IC50值為1.7±0.12μ M，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為23.69。IC50值的降低，BCRP是較晚發(fā)現(xiàn)的ABC家族成員，本研究中，功能上確定了MCF-7/Adr細胞中BCRP蛋白的外排功能，然后通過RT-PCR在細胞中檢測到了BCRP蛋白RNA水平的表達，最后發(fā)現(xiàn)對MCF-7及其耐藥細胞系MCF-7/Adr來說，Mitoxantrone的IC50值分別為37.72±1.85μ M和6.32±0.10μ M

4、，耐藥倍數(shù)為5.96倍；逆轉(zhuǎn)劑FTC處理過后的Mitoxantrone的IC50值為1.63±0.01，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為23.10。MRP1蛋白也是重要的多藥耐藥蛋白。本研究中，功能上確定了a549/DDP細胞中MRP1蛋白的外排功能，然后通過RT-PCR在細胞中檢測到了MRP1蛋白RNA水平的表達，最后發(fā)現(xiàn)a549及其耐藥細胞系a549/DDP，Doxorubicin的IC50值分別為4.43±0.248μ M和0.31±0.01μ M，耐

5、藥倍數(shù)達到了14.47倍。MK571處理過的a549/DDP的IC50為0.52±0.03μ M，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為8.57.
　　 其次利用建立好的篩選體系，從多種中草藥提取物和天然產(chǎn)物中，成功篩選出來了兩種具有逆轉(zhuǎn)活性的天然產(chǎn)物胡椒堿(Pip)和海罌粟堿(Gla)。其中，胡椒堿和海罌粟堿均對a549/DDP和MCF-7/Adr的耐藥性有一定的逆轉(zhuǎn)活性，且該活性具有一定的濃度依賴和時間依賴性。對于a549/DDP來說，50μ M胡椒堿

6、(Pip)處理后的IC50為0.28±0.02μ M，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)達到了14.14倍。對50μ M海罌粟堿(Gla)處理后的IC50為0.60±0.06μ M，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)也達到了12.42倍；對于MCF-7/Adr來說，50μ M胡椒堿(Pip)處理后的IC50為1.26±0.20μ M，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)達到了32.15倍。而對50μ M海罌粟堿(Gla)處理后的IC50為0.86±0.23μ M，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)也達到了46.64倍。
　　 最后，