四逆湯化學(xué)成分和抗心肌缺血作用的研究.pdf

1、四逆湯是《傷寒論》的經(jīng)典要方,由附子、干姜和甘草組成。四逆湯組方精良,配伍嚴(yán)謹(jǐn)?，F(xiàn)代研究表明,四逆湯在心、腦血管疾病的預(yù)防和臨床治療中表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢和作用特點(diǎn)。附子是四逆湯的君藥,主要含生物堿類成分；干姜主要含揮發(fā)油成分和二苯庚烷、姜辣素類等不揮發(fā)性成分；甘草主要含三萜皂苷和黃酮類成分。 本課題在組方藥材淡附片、干姜、炙甘草及四逆湯HPLC-MS指紋圖譜研究的基礎(chǔ)上,采用HPLC-TOF-MS進(jìn)行組方藥材和四逆湯的化學(xué)成分分析

2、研究,建立四逆湯HPLC-TOF-MS指紋圖譜表征四逆湯化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法,進(jìn)行不同配比四逆湯指紋圖譜與抗心肌缺血作用的評(píng)價(jià),確定四逆湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及可能的藥效成分,建立了全新的中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)評(píng)價(jià)方法。結(jié)合四逆湯的拆方研究,對(duì)化學(xué)計(jì)量學(xué)的研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。 一、四逆湯化學(xué)成分的分析研究 (一)四逆湯HPLC-MS指紋圖譜的研究 分別建立烏頭堿、6-姜酚和甘草酸等3個(gè)成分的HPLC快速測定方法

3、,并分別以淡附片、干姜和炙甘草中3個(gè)成分的含量為指標(biāo),采用正交設(shè)計(jì)的方法,優(yōu)化固液比例、浸泡時(shí)間和超聲時(shí)間等前處理因素,確定甲醇超聲提取的最佳條件。分別建立四逆湯3個(gè)組方藥材淡附片、干姜和炙甘草的HPLC-MS指紋圖譜,進(jìn)行方法學(xué)考察,獲取組方藥材甲醇提取液和水煎液的指紋圖譜。 在組方藥材HPLC-MS指紋圖譜研究的基礎(chǔ)上,對(duì)四逆湯HPLC-MS指紋圖譜的流動(dòng)相體系、醋酸含量和醋酸銨濃度等色譜條件進(jìn)行逐步優(yōu)化,選擇乙腈-2 mm

4、ol/L醋酸銨溶液(含0.01％醋酸)梯度洗脫為色譜條件。在正離子檢測模式,掃描范圍m/z 200～1200建立四逆湯HPLC-MS指紋圖譜。 以干姜揮發(fā)油的得率為指標(biāo),分別采用正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)的方法對(duì)水蒸氣蒸餾條件進(jìn)行優(yōu)化,選擇加17倍量水,提取8h為提取條件,建立干姜揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜并鑒別揮發(fā)油中的化學(xué)成分。 (二)四逆湯HPLC-TOF-MS化學(xué)成分的分析研究 根據(jù)組方藥材中化學(xué)成分的類別,分別建

5、立5個(gè)化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫,分別包括淡附片生物堿類、干姜二苯庚烷類和姜辣素類、炙甘草三萜皂苷類和黃酮類化學(xué)成分。通過HPLC-TOF-MS分析組方藥材甲醇提取液和水煎液的化學(xué)成分,對(duì)已知化合物和未知化合物分別進(jìn)行匹配和標(biāo)記,表征組方藥材的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上,通過HPLC-TOF-MS分析四逆湯的化學(xué)成分,表征四逆湯的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。從四逆湯HPLC-TOF-MS總離子流色譜圖中發(fā)現(xiàn)156個(gè)色譜峰,其中49個(gè)色譜峰來自淡附片,40個(gè)色譜峰來

6、自干姜,67個(gè)色譜峰來自炙甘草,根據(jù)準(zhǔn)確分子量、同位素分布、元素組成和保留時(shí)間可以鑒定其中19個(gè)色譜峰為已知生物堿類化合物,18個(gè)色譜峰為已知二苯庚烷類化合物,13個(gè)色譜峰為已知姜辣素類化合物,12個(gè)色譜峰為已知三萜皂苷類化合物,23個(gè)色譜峰為已知黃酮類化合物,其余色譜峰為來自各組方藥材的相應(yīng)未知化合物。 二、四逆湯抗心肌缺血作用的研究 (一)四逆湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究 采用小鼠腹腔注射垂體后葉素建立急性心肌缺血模

7、型,選擇心肌組織SOD的活性為指標(biāo)。在HPLC-TOF-MS化學(xué)成分指紋圖譜研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)行不同配比四逆湯的抗心肌缺血作用研究,將色譜峰面積的變化與小鼠心肌組織SOD的活性相關(guān)聯(lián),采用相關(guān)分析和多元線性回歸方法確認(rèn)四逆湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及可能的藥效成分,同時(shí)明確組方藥材來源,實(shí)現(xiàn)從化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)到藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的提升。 采用相關(guān)分析的方法,確認(rèn)22個(gè)化合物的色譜峰為四逆湯抗心肌缺血的可能的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),其中11個(gè)色譜峰為已知生物堿類

8、化合物,3個(gè)色譜峰為已知二苯庚烷類化合物,2個(gè)色譜峰為已知姜辣素類化合物,其余6個(gè)未知化合物色譜峰有4個(gè)來自淡附片,各有1個(gè)來自干姜和炙甘草。采用多元線性回歸的方法,確認(rèn)2個(gè)生物堿類化合物森布星B和去甲豬毛菜堿為四逆湯中可能藥效成分。從藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和藥效成分的分析結(jié)果中,可以發(fā)現(xiàn)淡附片在四逆湯抗心肌缺血作用中具有突出的作用。 (二)四逆湯抗心肌缺血作用的拆方研究 選擇小鼠心肌組織SOD活性為指標(biāo),通過比較整方四逆湯、缺味