菠菜雄性偏向NUPTs的分離與染色體定位.pdf

1、菠菜（Spinacia.oleracea L.）是藜科(Chenopodiaceae)菠菜屬（Spinacia）一年生或兩年生草本植物，是一種廣泛種植的雌雄異株的經(jīng)濟(jì)作物。菠菜基因組大小為989Mbp，染色體組型為2n=12，具有XY異型染色體。菠菜的性染色體為1號(hào)染色體，處于性染色體演化的較早期階段。由于菠菜的生長(zhǎng)周期短，易于繁殖，染色體數(shù)目少，因此是研究植物性別分化和性染色體演化的理想材料。細(xì)胞器DNA片段轉(zhuǎn)移到核基因組中是真核生物

2、中普遍發(fā)生的現(xiàn)象。在高等植物中，質(zhì)體DNA轉(zhuǎn)移并整合到核基因組中會(huì)形成核質(zhì)體DNA(nuclear plastid DNA，NUPTs)。最新的研究發(fā)現(xiàn)NUPTs在雌雄異株的白麥瓶草的Y染色體上特異性的累積，說明NUPTs可能和性染色體的起源和演化具有一定的聯(lián)系。但是，NUPTs的這種性染色體的累積是否是普通現(xiàn)象，如果是，又是如何參與性染色體的起源和演化的等問題仍不清楚。
　　鑒于此，本研究以菠菜為實(shí)驗(yàn)材料，利用基因組消減雜交技術(shù)

3、篩選分離菠菜雌雄基因組差異的NUPTs序列，根據(jù)菠菜葉綠體基因組數(shù)據(jù)獲得長(zhǎng)片段NUPTs序列并利用染色體熒光原位雜交技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證和染色體定位分析，為探討菠菜葉綠體基因組向核基因組轉(zhuǎn)移的研究和染色體演化的研究提供數(shù)據(jù)資料。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)構(gòu)建了菠菜的消減雜交文庫，從文庫中挑選出4706個(gè)單菌落進(jìn)行菌落PCR，再對(duì)篩選出來的陽性克隆進(jìn)行斑點(diǎn)雜交驗(yàn)證。共得到39條雄性特異的有效序列，所得到的序列平均長(zhǎng)度約為154 bp，

4、最長(zhǎng)的為308 bp，最短為75 bp。對(duì)獲得的序列進(jìn)行Blastn同源比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，有23條有同源比對(duì)結(jié)果，其中有12條序列與葉綠體有關(guān)，與菠菜葉綠體基因組相似度在98％以上。另有16條為新序列。
　　(2)將篩選出的與葉綠體有關(guān)的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)引物和PCR驗(yàn)證，最終得到兩條雌雄基因組差異序列（分別命名為sp5和sp8)，其長(zhǎng)度為分別為146bp和199bp。將sp5和sp8和NCBI數(shù)據(jù)庫中菠菜葉綠體基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行相似性比對(duì)，并

5、根據(jù)目的序列所在位置兩側(cè)序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行sp5和sp8長(zhǎng)片段擴(kuò)增，獲得了長(zhǎng)度分別為3706 bp和2391 bp的長(zhǎng)序列（分別命名為sp5-L和sp8-L）?；蚪M半定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，兩條NUPTs序列在菠菜的雌雄基因組上有明顯的差異，表現(xiàn)出雄性偏好，說明所獲得的兩個(gè)NUPTs序列在雄性基因組中有更多的積累。
　　(3)為了進(jìn)一步分析sp5-L和sp8-L在染色體上的位置分布特點(diǎn)，利用染色體原位雜交技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了中期染色體定位。