菠菜雄性偏向NUPTs的分離與染色體定位.pdf

1、菠菜（Spinacia.oleracea L.）是藜科(Chenopodiaceae)菠菜屬（Spinacia）一年生或兩年生草本植物，是一種廣泛種植的雌雄異株的經(jīng)濟作物。菠菜基因組大小為989Mbp，染色體組型為2n=12，具有XY異型染色體。菠菜的性染色體為1號染色體，處于性染色體演化的較早期階段。由于菠菜的生長周期短，易于繁殖，染色體數(shù)目少，因此是研究植物性別分化和性染色體演化的理想材料。細胞器DNA片段轉移到核基因組中是真核生物

2、中普遍發(fā)生的現(xiàn)象。在高等植物中，質體DNA轉移并整合到核基因組中會形成核質體DNA(nuclear plastid DNA，NUPTs)。最新的研究發(fā)現(xiàn)NUPTs在雌雄異株的白麥瓶草的Y染色體上特異性的累積，說明NUPTs可能和性染色體的起源和演化具有一定的聯(lián)系。但是，NUPTs的這種性染色體的累積是否是普通現(xiàn)象，如果是，又是如何參與性染色體的起源和演化的等問題仍不清楚。
　　鑒于此，本研究以菠菜為實驗材料，利用基因組消減雜交技術

3、篩選分離菠菜雌雄基因組差異的NUPTs序列，根據(jù)菠菜葉綠體基因組數(shù)據(jù)獲得長片段NUPTs序列并利用染色體熒光原位雜交技術進行了驗證和染色體定位分析，為探討菠菜葉綠體基因組向核基因組轉移的研究和染色體演化的研究提供數(shù)據(jù)資料。主要研究結果如下:
　　(1)構建了菠菜的消減雜交文庫，從文庫中挑選出4706個單菌落進行菌落PCR，再對篩選出來的陽性克隆進行斑點雜交驗證。共得到39條雄性特異的有效序列，所得到的序列平均長度約為154 bp，

4、最長的為308 bp，最短為75 bp。對獲得的序列進行Blastn同源比對分析發(fā)現(xiàn)，有23條有同源比對結果，其中有12條序列與葉綠體有關，與菠菜葉綠體基因組相似度在98％以上。另有16條為新序列。
　　(2)將篩選出的與葉綠體有關的序列進行設計引物和PCR驗證，最終得到兩條雌雄基因組差異序列（分別命名為sp5和sp8)，其長度為分別為146bp和199bp。將sp5和sp8和NCBI數(shù)據(jù)庫中菠菜葉綠體基因組數(shù)據(jù)進行相似性比對，并

5、根據(jù)目的序列所在位置兩側序列設計引物進行sp5和sp8長片段擴增，獲得了長度分別為3706 bp和2391 bp的長序列（分別命名為sp5-L和sp8-L）?；蚪M半定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，兩條NUPTs序列在菠菜的雌雄基因組上有明顯的差異，表現(xiàn)出雄性偏好，說明所獲得的兩個NUPTs序列在雄性基因組中有更多的積累。
　　(3)為了進一步分析sp5-L和sp8-L在染色體上的位置分布特點，利用染色體原位雜交技術對其進行了中期染色體定位。