綿羊種布魯氏菌致病的分子機制研究.pdf

1、目的：布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種人、畜共患傳染病。人感染后表現(xiàn)為“波浪熱”,家畜感染后易造成流產(chǎn)。病原學(xué)研究發(fā)現(xiàn),布魯氏菌外膜蛋白和Ⅳ型分泌系統(tǒng)家族蛋白與布魯氏菌的侵染、胞內(nèi)生存、繁殖有直接關(guān)系,是公認(rèn)的毒力因子。探討布魯氏菌的胞內(nèi)寄生機制的分子基礎(chǔ)與布魯氏菌毒力因子和巨噬細(xì)胞靶蛋白結(jié)合密不可分,進而為繪制布魯氏菌表面蛋白與巨噬細(xì)胞相互作用的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)提供技術(shù)方案,為選擇布魯氏菌病藥物作用的侯選靶點奠定理論依據(jù),為抗布魯氏菌病的綿

2、羊抗病育種工作提供可供篩選、比較的侯選基因。 方法：(1)利用高變8聚核苷酸DNA指紋技術(shù)(HOOF-Prints)對綿羊種布魯氏菌019株可變數(shù)目重復(fù)片段(V-NTR)的8個位點進行PCR擴增和序列測定,將測定結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析,構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,確立綿羊種布魯氏菌019株在布魯氏菌分類學(xué)中的地位；(2)用分子克隆技術(shù)對綿羊種布魯氏菌019株的目標(biāo)基因(外膜蛋白基因omp31和IV型分泌系統(tǒng)蛋白基因virB2、v

3、irB3、virB5、virB8基因)進行克隆、測序,并將目標(biāo)基因構(gòu)建到酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7中：(3)建立綿羊種布魯氏菌019株侵染綿羊肺泡巨噬細(xì)胞的感染模型,利用酵母雙雜交捕獲載體系統(tǒng)構(gòu)建綿羊巨噬細(xì)胞cDNA文庫；(4)利用構(gòu)建的酵母雙雜交誘餌系統(tǒng)和捕獲系統(tǒng)進行巨噬細(xì)胞捕獲蛋白的篩選,并對部分捕獲蛋白應(yīng)用免疫共沉淀驗證,確立互作的靶蛋白。 結(jié)果：(1)綿羊種布魯氏菌019株八個位點的重復(fù)序列與參考株對應(yīng)序列相比,一致

4、性較差,只有Locus1,Locus6和Locus8與綿羊種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)株63/290的對應(yīng)位點重復(fù)序列一致,而019株的8個位點重復(fù)序列與B.abortus 2308、B.suis 1330的對應(yīng)位點沒有共同的重復(fù)序列次數(shù),遺傳進化樹分析,綿羊種布魯氏菌019株與標(biāo)準(zhǔn)株63/290的親緣關(guān)系最高；(2)測序表明綿羊種布魯氏菌019株omp31、virB2、virB3、virB5和virB8基因與參考株對應(yīng)基因相比,兩者omp31基因的

5、同源性為98％,兩者virB5、virB8基因的同源性為99％,兩者virB2、virB3基因的同源性為100％,攜帶有目標(biāo)基因的誘餌系統(tǒng)無自激活活性：(3)構(gòu)建的綿羊種布魯氏菌019株侵染綿羊巨噬細(xì)胞cDNA文庫的庫容量為1.364×105,重組率為95.65％；(4)酵母雙雜交結(jié)果顯示:pGBKT7-omp31誘餌質(zhì)粒最終獲得2個陽性AD質(zhì)粒,這些質(zhì)粒的插入片段與牛的特異性半乳糖苷凝集素、趨化因子配體16高度同源:pGBKT7-vi

6、rB2誘餌質(zhì)粒最終獲得3個陽性AD質(zhì)粒,這些質(zhì)粒的插入片段與牛的CD48分子、趨化因子配體、溶酶體輔助蛋白2高度同源:pGBKT7-virB3誘餌質(zhì)粒最終獲得2個陽性AD質(zhì)粒,這些質(zhì)粒的插入片段與牛的溶酶體輔助蛋白2、未知蛋白高度同源；pGBKT7-virB5誘餌質(zhì)粒最終獲得3個陽性AD質(zhì)粒,這些質(zhì)粒的插入片段與牛的嘌呤核苷酸磷酸酶、含鐵素重鏈多肽、26S蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞基8高度同源；pGBKT7-virB8誘餌質(zhì)粒最終獲得9個

7、不同的陽性AD質(zhì)粒,這些質(zhì)粒的插入片段與牛的IGS15泛素樣修飾子、腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白、脂肪酸結(jié)合蛋白4、C19orf10樣蛋白、趨化因子配體16、N-myc作用子、類固醇樣急性凋節(jié)蛋白、2種未知蛋白高度同源；免疫共沉淀結(jié)果顯示：外膜蛋白OMP31與綿羊巨噬細(xì)胞特異性半乳糖苷凝集素和類趨化因子(C-X-Cmotif)配體16發(fā)生相互作用；Ⅳ型分泌系統(tǒng)家族蛋白VirB5與綿羊巨噬細(xì)胞含鐵素重鏈多肽發(fā)生相互作用。 結(jié)論：(1)綿羊