綿羊布魯氏菌侵染小鼠巨噬細(xì)胞過程的熒光表征與分析.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)GFP的整合型重組布魯氏菌16M和M5(以下簡(jiǎn)稱GFP-布魯氏菌16M和M5);比較GFP-布魯氏菌16M和M5與正常布魯氏菌16M和M5在巨噬細(xì)胞中的存活能力,證明GFP基因的轉(zhuǎn)入不會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。分析GFP-布魯氏菌16M和M5進(jìn)入細(xì)胞后與宿主細(xì)胞中的溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體結(jié)合產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度;分析GFP-布魯氏菌16M和M5侵染小鼠巨噬細(xì)胞的數(shù)量;對(duì)侵染初期與胞內(nèi)溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體結(jié)合的時(shí)

2、間測(cè)定,為布魯氏菌在細(xì)胞內(nèi)的生存繁殖及其分子機(jī)制研究提供理論參考。
　　方法:
　　將pMC-221-GFP載體電轉(zhuǎn)化進(jìn)入布魯氏菌16M和M5感受態(tài)細(xì)胞,穩(wěn)定傳代后獲得GFP-布魯氏菌16M和M5。將GFP-布魯氏菌16M和M5與正常布魯氏菌16M和M5培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期收集菌體,用麥?zhǔn)媳葷岱ㄖ了铦舛?按照細(xì)菌和細(xì)胞比例為100:1進(jìn)行侵染,利用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)其在胞內(nèi)的存活能力;激光共聚焦顯微鏡觀察胞內(nèi)GFP-布魯氏菌與溶酶體,

3、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的結(jié)合,并檢測(cè)出GFP-布魯氏菌16M和M5與溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體結(jié)合后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度;用流式細(xì)胞儀測(cè)定侵染初期GFP-布魯氏菌進(jìn)入細(xì)胞及與胞內(nèi)溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體初次結(jié)合的時(shí)間。
　　結(jié)果:
　　(1)成功獲得整合重組型GFP-布魯氏菌16M和M5。
　　(2)GFP-布魯氏菌16M和M5與正常布魯氏菌16M和M5比較發(fā)現(xiàn)在小鼠巨噬細(xì)胞中的存活能力并無差別。
　　(3)GFP-布魯氏

4、菌16M與溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和高爾基體結(jié)合初期產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與布魯氏菌M5相比較并無明顯差異。
　　(4)GFP-布魯氏菌16M和M5侵染初期小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的GFP+巨噬細(xì)胞沒有明顯區(qū)別,但是后期差距逐漸明顯。
　　(5)GFP-布魯氏菌16M和M5侵染初期10min進(jìn)入巨噬細(xì)胞,1.5 h布魯氏菌到達(dá)溶酶體,2 h布魯氏菌同時(shí)到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和高爾基體。
　　結(jié)論:
　　(1)GFP基因的整合重組并不會(huì)

5、影響布魯氏菌16M和M5的生物特性。
　　(2)GFP-布魯氏菌16M和M5在侵染初期結(jié)合宿主細(xì)胞及胞內(nèi)溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的時(shí)間相同,這可能與二者同屬布魯氏菌Ⅰ型標(biāo)準(zhǔn)菌株有關(guān)。
　　(3)GFP-布魯氏菌到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的時(shí)間相同,這可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的膜轉(zhuǎn)移蛋白有關(guān)。
　　(4)雖然布魯氏菌16M和M5在侵染初期熒光強(qiáng)度和GFP+巨噬細(xì)胞數(shù)量上沒有顯著差別,但是胞內(nèi)存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻恰恰相反。由此認(rèn)為布