羊種布魯氏菌感染胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的分子機(jī)制研究.pdf

1、布魯氏菌?。ê喎Q布病）是由布魯氏菌引起的一類動物源性人獸共患病，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，尤其是發(fā)展中國家。近幾年回升勢頭迅猛，引起了世界范圍的廣泛關(guān)注，為此，我國緊急發(fā)布了《關(guān)于加強(qiáng)布魯氏菌防治工作的通知》。布魯氏菌是一種兼性胞內(nèi)寄生致病菌，侵襲力強(qiáng)、傳染途徑多，人感染后呈持續(xù)性感染，目前尚無法根治；家畜感染后主要引發(fā)母畜流產(chǎn)，給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。動物胎盤中含有大量的赤蘚醇，能夠促進(jìn)布魯氏菌的生長，布魯氏菌對胎盤具有顯著的親嗜性，胚

2、胎滋養(yǎng)細(xì)胞是母體和胎兒的聯(lián)系紐帶，同時也是布魯氏菌感染的靶細(xì)胞，一旦受到損傷，就會導(dǎo)致流產(chǎn)，但引發(fā)流產(chǎn)的分子機(jī)制還不清楚。為此，本研究以布魯氏菌和胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞為研究對象，主要展開以下的研究工作： 1.羊種布魯氏菌的分離鑒定及ELISA檢測方法的建立。通過采用細(xì)菌群體形態(tài)觀察、PCR、生化試驗對分離培養(yǎng)的菌株進(jìn)行鑒定，獲得了羊種布魯氏菌生物3型l株，命名為027株，對其SP41基因進(jìn)行克隆、表達(dá)、純化，包被酶標(biāo)反應(yīng)板并進(jìn)行樣本檢

3、測。結(jié)果布魯氏菌病間接ELISA檢測方法的最優(yōu)條件是重組蛋白SP41最佳抗原包被濃度為0.6μg/mL，最佳血清稀釋度為1：50，該方法重復(fù)性好、特異性強(qiáng)，樣本陽性檢出率高于虎紅平板試驗和試管凝集試驗。 2.羊種布魯氏菌ery操縱子在感染人胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞HPT-8過程中的表達(dá)調(diào)控。采用實時定量PCR方法檢測了布魯氏菌侵染HPT-8細(xì)胞過程中ery操縱子4個基因在未侵染、侵染20min、1h、2h、3h、4h時的表達(dá)差異，結(jié)果er

4、y操縱子在侵染前后的表達(dá)有明顯差異，eryA、eryB、eryC相對表達(dá)量在侵染2h時表達(dá)量最高，eryD在3h時的相對表達(dá)量最高，其余狀態(tài)下的表達(dá)量都很低，并且隨著eryD表達(dá)量升高，eryA、eryB、eryC的表達(dá)量降低。 3.建立羊種布魯氏菌027株侵染HPT-8細(xì)胞的cDNA文庫。分別提取布魯氏菌侵染20min、1h、2h、3h、4h后HPT-8細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，同源重組法構(gòu)建布魯氏菌侵染HPT-8細(xì)胞

5、的cDNA文庫，并對部分EST進(jìn)行測序分析，結(jié)果羊種布魯氏菌027株侵染人滋養(yǎng)層cDNA文庫的庫容為1.43×106，重組率為96.92％，插入片段大小在0.2-5kb；對文庫63個克隆進(jìn)行測序，用BlastX和BlastN進(jìn)行序列同源性比對，并將63個基因進(jìn)行了功能分類。然后，構(gòu)建pGBKT7-omp25誘餌質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化酵母Y187，結(jié)果表明誘餌菌無自激活活性、無毒性。 4.篩選并驗證與布魯氏菌流產(chǎn)相關(guān)因子互作的HPT-8細(xì)胞靶

6、蛋白。采用酵母雙雜交技術(shù)篩選與布魯氏菌外膜蛋白OMP25互作的HPT-8細(xì)胞捕獲蛋白，并采用免疫共沉淀技術(shù)驗證互作的蛋白。共篩選出了7個與布魯氏菌OMP25誘餌蛋白相結(jié)合陽性捕獲蛋白，驗證試驗表明布魯氏菌外膜蛋白OMP25與HPT-8細(xì)胞的Ferritin、hypothetical LOC339123蛋白發(fā)生了相互作用。 5.分析捕獲蛋白在布魯氏菌侵染HPT-8細(xì)胞過程中的作用。根據(jù)鐵蛋白、hypothetical LOC339

7、123蛋白核苷酸序列，分別構(gòu)建了3個特異性shRNA干擾載體，轉(zhuǎn)染HPT-8細(xì)胞，實時定量PCR檢測2個基因的表達(dá)水平，檢驗其干擾效率；采用布魯氏菌感染轉(zhuǎn)染shRNA干擾載體前、后的HPT-8細(xì)胞，檢測布魯氏菌的相對數(shù)量。結(jié)果針對鐵蛋白、hypothetical LOC339123合成的shRNA干擾片段與各自的混合組的干擾效果基本一致，F(xiàn)erritin混合組的干擾抑制率為76.18％，hypothetical LOC339123混合組

8、的干擾抑制率為71.11％。針對鐵蛋白的干擾載體混合組轉(zhuǎn)染前后，布魯氏菌相對數(shù)量差異較大，而hypothetical LOC339123的差異不明顯。 以上研究結(jié)果表明，分離培養(yǎng)的布魯氏菌027株為羊種布魯氏菌生物3型；成功構(gòu)建了基于重組蛋白SP41的布魯氏菌病間接ELISA檢測方法；布魯氏菌感染HPT-8細(xì)胞過程中ery操縱子4個基因在不同時間點表達(dá)存在著差異；成功構(gòu)建了羊種布魯氏菌027株侵染HPT-8細(xì)胞的cDNA文庫；布